CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos
Summary
Aquí, se presenta el ensamblaje de quimeras mediante la recuperación de plásmidos y la inserción en el sitio de enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo basado en la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas y recuperación funcional de plásmidos. Este protocolo es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.
Abstract
En este caso, presentamos el ensamblaje de la quimera mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI). CAPRRESI se beneficia de muchas fortalezas del método original de recuperación de plásmidos e introduce la digestión con enzimas de restricción para facilitar las reacciones de ligación de ADN (necesarias para el montaje de quimeras). Para este protocolo, los usuarios clonan genes de tipo salvaje en el mismo plásmido (pUC18 o pUC19). Después de la selección in silico de las regiones de secuencia de aminoácidos en las que deberían montarse quimeras, los usuarios obtienen todas las secuencias de ADN sinónimas que las codifican. Los scripts Perl ad hoc permiten a los usuarios determinar todas las secuencias de ADN del sinónimo. Después de este paso, otro script Perl busca sitios de enzimas de restricción en todas las secuencias de ADN sinónimas. Este análisis in silico también se realiza usando el gen de resistencia a ampicilina ( ampR ) encontrado en plásmidos pUC18 / 19. Los usuarios diseñan oligonucleótidos dentro de regiones sinónimas para interrumpir genes de tipo salvaje y ampR por PCR. Después de obtY purificación de fragmentos de ADN complementarios, se lleva a cabo la digestión con enzimas de restricción. El montaje de la quimera se logra mediante ligación de fragmentos de ADN complementarios apropiados. Los vectores pUC18 / 19 se seleccionan para CAPRRESI porque ofrecen ventajas técnicas, tales como tamaño pequeño (2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial. El uso de enzimas de restricción para el montaje de quimeras elimina la necesidad de polimerasas de ADN que producen productos de extremos romos. CAPRRESI es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.
Introduction
El montaje de genes quiméricos ha sido ampliamente utilizado en biología molecular para elucidar la función de la proteína y / o para propósitos biotecnológicos. Existen diferentes métodos para fusionar genes, tales como la superposición de la amplificación del producto de PCR 1 , la recuperación 2 del plásmido, la recombinación homóloga 3 , los sistemas CRISPR-Cas9 4 , la recombinación dirigida 5 y el conjunto 6 de Gibson. Cada una de ellas ofrece diferentes ventajas técnicas; Por ejemplo, la flexibilidad del diseño de PCR superpuesto, la selección in vivo de construcciones durante la recuperación del plásmido o la alta eficiencia de los sistemas CRISPR-Cas9 y Gibson. Por otro lado, pueden surgir algunas dificultades al realizar algunos de estos métodos; Por ejemplo, los dos primeros enfoques se basan en fragmentos de ADN de extremos romos, y la ligadura de estos tipos de productos podría ser técnicamente difícil en comparación con sticKy-terminó ligadura. La recombinación dirigida puede dejar trazas de secuencias de ADN adicionales (cicatrices) en el original, como en el sistema CreloxP 5 . CRISPR-Cas9 a veces puede modificar otras regiones del genoma, además de la meta de sitio [ 4] .
Aquí, se introduce el conjunto de quimeras mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo para fusionar genes que codifican proteínas que combina el método de recuperación de plásmidos (PRM) con la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas, . Para asegurar la integridad de la secuencia de aminoácidos, los sitios de enzimas de restricción se insertan en secuencias de secuencia de ADN sinónimo. Entre los beneficios de CAPPRESI cabe destacar que puede realizarse con reactivos / herramientas de laboratorio comunes ( por ejemplo , enzimas, células competentes, soluciones y termociclador) y que puede dar resultados rápidos (cuando se utilizan las enzimas apropiadas). Basándose en la restricciónLos sitios de enzimas que emergen de secuencias de ADN sinónimas pueden limitar la selección de los puntos de fusión exactos dentro de las proteínas de interés. En tales casos, los genes diana deben fusionarse usando oligonucleótidos superpuestos, y los sitios de enzimas de restricción deben insertarse en el gen de resistencia del vector.
CAPRRESI consiste en siete pasos simples ( Figura 1 ): 1) selección del vector de clonación, pUC18 o pUC19 6 ; 2) análisis in silico de las secuencias de tipo salvaje a fusionar; 3) selección de las regiones de rotura para el montaje de la quimera y la interrupción del plásmido; 4) generación in silico de secuencias de ADN sinónimas que contienen sitios de enzimas de restricción; 5) clonación independiente de los genes de tipo salvaje en el plásmido seleccionado; 6) interrupción del plásmido por PCR, seguido de digestión con enzimas de restricción; Y 7) recuperación de plásmido usando ligación de ADN y transformación bacteriana. Los genes quiméricos producidos por esta técnica deben ser verificados wCon la secuenciación.
Los vectores pUC18 / 19 ofrecen ventajas técnicas para la clonación y montaje de quimeras, tales como tamaño pequeño ( es decir, 2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial 7 . Aquí, un huésped de Escherichia coli se utilizó para ensamblar y manejar las quimeras porque los cultivos bacterianos son baratos y crecen rápidamente. Teniendo en cuenta esto, será necesaria la clonación subsiguiente de los fragmentos de fusión en los plásmidos diana finales ( por ejemplo, vectores de expresión como pRK415 en bacterias o pCMV en células de mamífero).
CAPRRESI se ensayó por fusionar dos genes del factor sigma primario: E. colirpoD y Rhizobium etlisigA . Los factores sigma primarios son subunidades de ARN polimerasa responsables de la iniciación de la transcripción, y consisten en cuatro dominios ( es decir, σ1, σ2, σ3 y σ4) 8 . La longitud de la secuencia de aminoácidosH de proteínas codificadas por rpoD y sigA son 613 y 685, respectivamente. RpoD y SigA comparten 48% de identidad (98% de cobertura). Estos factores sigma primaria se dividieron en dos fragmentos complementarios entre las regiones σ2 y σ3. Se montaron dos genes quiméricos según este diseño: quimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) y quimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Los productos de fusión de ADN se verificaron por secuenciación.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI fue diseñado como una alternativa al PRM 2 . El PRM original es una técnica poderosa; Permite la fusión de secuencias de ADN a lo largo de cualquier parte de los genes seleccionados. Para PRM, los genes de tipo salvaje deben ser clonados en el mismo plásmido. Después de eso, los oligonucleótidos están diseñados dentro de genes de resistencia a antibióticos y de tipo salvaje encontrados en el plásmido. La ruptura del plásmido se consigue por PCR usando polimerasas de ADN de alt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (otorgamiento número 154833) y la Universidad Nacional Autónoma de México. Los autores desean agradecer a Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos y Soledad Juárez por su asesoramiento administrativo y técnico.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
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