CAPRRESI: Chimera Assembly genom Plasmid Recovery och Restriction Enzym Site Insertion
Summary
Här presenterar vi chimärmontering genom plasmidåtervinning och restriktionsenzymställeinsättning (CAPRRESI), ett protokoll baserat på införandet av restriktionsenzymställen i synonym-DNA-sekvenser och funktionell plasmidåtervinning. Detta protokoll är en snabb och billig metod för att fusera proteinkodande gener.
Abstract
Här presenterar vi chimera-montering genom plasmidåtervinning och restriktionsenzymställeinsättning (CAPRRESI). CAPRRESI drar fördel av många styrkor i den ursprungliga plasmidåtervinningsförfarandet och introducerar restriktionsenzym digerering för att underlätta DNA-ligeringsreaktioner (krävs för chimärmontering). För detta protokoll klonar användarna vildtypgener i samma plasmid (pUC18 eller pUC19). Efter det i silikoselektionen av aminosyrasekvensområden där chimärer ska monteras, erhåller användarna alla de synonym-DNA-sekvenser som kodar för dem. Ad hoc Perl-skript ger användarna möjlighet att bestämma alla synonym-DNA-sekvenser. Efter detta steg söker ett annat Perl-skript för restriktionsenzymställen på alla synonym-DNA-sekvenser. Detta i silicoanalys utförs också med användning av ampicillinresistensgenen ( ampR ) som finns på pUC18 / 19-plasmider. Användare designar oligonukleotider inom synonymområdena för att störa vildtyp och ampR- gener genom PCR. Efter obtSammansmältning och rening av komplementära DNA-fragment, uppnås restriktionsenzym digestion. Kimamasammansättningen uppnås genom att ligera lämpliga komplementära DNA-fragment. PUC18 / 19 vektorer väljs för CAPRRESI eftersom de erbjuder tekniska fördelar, såsom liten storlek (2 686 baspar), högkopieringsnummer, fördelaktiga sekvenseringsreaktionsegenskaper och kommersiell tillgänglighet. Användningen av restriktionsenzymer för chimergaggregation eliminerar behovet av DNA-polymeraser, vilket ger upphov till trubbiga produkter. CAPRRESI är en snabb och billig metod för att fusera proteinkodande gener.
Introduction
Chimärgenenheten har använts i stor utsträckning i molekylärbiologi för att belysa proteinfunktionen och / eller för biotekniska ändamål. Olika metoder finns för fusionsgener, såsom överlappande PCR-produktförstärkning 1 , plasmidåtervinning 2 , homolog rekombination 3 , CRISPR-Cas9-system 4 , platsreglerad rekombination 5 och Gibson-sammansättning 6 . Var och en av dessa erbjuder olika tekniska fördelar; Till exempel flexibiliteten hos överlappande PCR-konstruktion, valet av in vivo konstruktioner under plasmidåtervinning eller hög effektivitet av CRISPR-Cas9 och Gibson-system. Å andra sidan kan vissa svårigheter uppstå vid utförande av några av dessa metoder. Till exempel är de två första tillvägagångssätten beroende av trubbiga DNA-fragment, och ligering av dessa typer av produkter kan vara tekniskt utmanande jämfört med sticktKy-ändig ligering. Site-directed rekombination kan lämna spår av extra DNA-sekvenser (ärr) på originalet, som i CrexxP-systemet 5 . CRISPR-Cas9 kan ibland modifiera andra genomregioner utöver målplatsen 4 .
Här introducerar vi chimärmontering genom plasmidåtervinning och restriktionsenzymställeinsättning (CAPRRESI), ett protokoll för fusion av proteinkodande gener som kombinerar plasmidåtervinningsmetoden (PRM) med införandet av restriktionsenzymställen på synonym-DNA-sekvenser, förbättrande ligeringseffektivitet . För att säkerställa aminosyrasekvensintegritet insättas restriktionsenzymställen på synonyms DNA-sekvenssträckor. Bland fördelarna med CAPPRESI är att det kan utföras med vanliga laboratoriereagenser / verktyg ( t.ex. enzymer, kompetenta celler, lösningar och termocykler) och att det kan ge snabba resultat (när lämpliga enzymer används). Lita på begränsningEnzymställen som kommer från synonym-DNA-sekvenser kan begränsa urvalet av exakta fusionspunkter inom proteinerna av intresse. I sådana fall bör målgener fusioneras med användning av överlappande oligonukleotider, och restriktionsenzymställen bör införas på vektorens resistensgen.
CAPRRESI består av sju enkla steg ( Figur 1 ): 1) Val av kloningsvektor, pUC18 eller pUC196; 2) i silikoanalys av vildtypsekvenserna som skall fusioneras; 3) selektion av brytregioner för chimärmontering och plasmidavbrott; 4) i silico- generering av synonym-DNA-sekvenser innehållande restriktionsenzymställen; 5) oberoende kloning av vildtypgenerna i den valda plasmiden; 6) plasmidstörning genom PCR, följt av restriktionsenzym-digestion; Och 7) plasmidåtervinning med användning av DNA-ligering och bakteriell transformation. Chimära gener som framställs genom denna teknik bör verifieras wI följd.
PUC18 / 19-vektorerna erbjuder tekniska fördelar för kloning och chimärmontering, såsom liten storlek ( dvs. 2 686 baspar), högkopiantal, fördelaktiga sekvenseringsreaktionsegenskaper och kommersiell tillgänglighet 7 . Här användes en Escherichia coli värd för att montera och hantera chimärerna eftersom bakteriekulturer är billiga och växer snabbt. Med tanke på detta kommer efterföljande kloning av fusionsfragmenten i de slutliga målplasmiderna att behövas (t ex expressionsvektorer som pRK415 i bakterier eller pCMV i däggdjursceller).
CAPRRESI testades för att fusera två primära sigmafaktorgener: E. colirpoD och Rhizobium etlisigA . Primär-sigmafaktorer är RNA-polymeras-subenheter som är ansvariga för transkriptionsinitiering, och de består av fyra domäner ( dvs σ1, σ2, σ3 och σ4) 8 . Aminosyrasekvensen längsH av proteiner kodade av rpoD och sigA är 613 respektive 685. RpoD och SigA delar 48% identitet (98% täckning). Dessa primära sigmafaktorer delades upp i två komplementära fragment mellan regionerna σ2 och σ3. Två chimära gener sammanställdes enligt denna design: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) och chimär 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusionsprodukter verifierades genom sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI designades som ett alternativ till PRM 2 . Den ursprungliga PRM är en kraftfull teknik; Det möjliggör fusion av DNA-sekvenser längs någon del av de valda generna. För PRM bör vildtypgener klonas i samma plasmid. Därefter konstrueras oligonukleotider inuti vildtyp och antibiotikaresistensgener som finns på plasmiden. Plasmidförstöring uppnås genom PCR med användning av trubbiga, högfideliga DNA-polymeraser och tidigare utformade oligonukleotider. Ligeringen av komplementära…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Consejo Nacional de Ciencia och Tecnología, CONACYT, México (bidrag nr 154833) och Universidad Nacional Autónoma de México. Författarna vill tacka Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos och Soledad Juárez för deras administrativa och tekniska råd.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
