Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Marisa E. Miller; Katie L. Liberatore; Shahryar F. Kianian

doi:10.3791/55528

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Article de méthode

Optimisation et analyse comparative des méthodes d'enrichissement de l'ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

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DOI :

10.3791/55528

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28 juillet 2017

Marisa E. Miller^*¹^,² , Katie L. Liberatore^*¹^,³ , Shahryar F. Kianian¹^,³

¹Cereal Disease Laboratory, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, ²Department of Horticultural Science, University of Minnesota, ³Department of Plant Pathology, University of Minnesota

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Résumé

Les génomes organellaires végétaux contiennent de gros éléments répétitifs qui peuvent faire l'objet d'un couplage ou d'une recombinaison pour former des structures complexes et / ou des fragments sub-génomiques. Les génomes organellés existent également dans des mélanges à l'intérieur d'une cellule ou d'un type de tissu (hétéroplasmique) donné, et une abondance de sous-types peut changer tout au long du développement ou sous stress (déplacement sous-stoechiométrique). Les technologies de séquençage de la prochaine génération (NGS) sont nécessaires pour obtenir une compréhension plus approfondie de la structure et de la fonction du génome organellaire. Les études de séquençage traditionnelles utilisent plusieurs méthodes pour obtenir l'ADN organellaire: (1) Si une grande quantité de tissu de départ est utilisée, elle est homogénéisée et soumise à une centrifugation différentielle et / ou à une purification par gradient. (2) Si une quantité plus petite de tissu est utilisée ( c'est-à-dire, si les graines, le matériau ou l'espace est limité), le même processus est effectué comme dans (1), suivi d'une amplification complète du génome pour obtenir un ADN suffisant. (3) L'analyse de bioinformatique peut être utilisée pour seqL'ADN génomique total et d'analyser les lectures organiques. Toutes ces méthodes ont des défis et des compromis inhérents. Dans (1), il peut être difficile d'obtenir une telle quantité importante de tissu de départ; Dans (2), l'amplification du génome entier pourrait introduire un biais de séquençage; Et dans (3), l'homologie entre génomes nucléaires et organellars pourrait entraver l'assemblage et l'analyse. Dans les plantes à grands génomes nucléaires, il est avantageux d'enrichir l'ADN organellaire pour réduire les coûts de séquençage et la complexité des séquences pour les analyses de bioinformatique. Ici, nous comparons une méthode de centrifugation différentielle traditionnelle avec une quatrième méthode, une approche CpG-méthyle modifiée, pour séparer l'ADN génomique total en fractions nucléaires et organellaires. Les deux méthodes produisent suffisamment d'ADN pour le NGS, l'ADN qui est très enrichi pour les séquences organellaires, mais à des rapports différents dans les mitochondries et les chloroplastes. Nous présentons l'optimisation de ces méthodes pour le tissu des feuilles de blé et discutons des avantages majeurs et dDes avantages de chaque approche dans le contexte de l'apport d'échantillon, la facilité du protocole et l'application en aval.

Introduction

Le séquençage du génome est un outil puissant pour disséquer la base génétique sous-jacente des traits importants de la plante. La plupart des études de séquençage génomique se concentrent sur le contenu du génome nucléaire, car la majorité des gènes sont situés dans le noyau. Cependant, les génomes organellars, y compris les mitochondries (à travers les eucaryotes) et les plastides (dans les plantes, la forme spécialisée, le chloroplaste, les travaux de la photosynthèse) apportent des informations génétiques importantes essentielles au développement de l'organisme, à la réponse au stress et à la condition physique globale ¹ . Les gé....