In vitro Imaging og Kvantificering af Drug Targeting Effektivitet af fluorescens-mærkede GnRH-analoger
Summary
Selektivt mærket fluorescerende GnRH-I, -II og-III derivater er pålidelige værktøjer til sporing og kvantificering deres cellulære optagelse. Dette håndskrift introducerer eksperimenter for at visualisere, kvantificere og sammenligne optagelsen effektiviteten af disse GnRH konjugater i forskellige cellelinier.
Abstract
GnRH-analoger er effektive målretning dele og i stand til at levere anticancer midler selektivt til maligne tumorceller som meget udtrykkelige GnRH-receptorer. Dog er kvantitativ analyse af GnRH-analoger 'cellulære optagelse og de undersøgte celletyper i GnRH-baserede drug delivery systemer øjeblikket er begrænset. Tidligere indførte, selektivt mærket fluorescerende GnRH I, -II og-III-derivater giver stor detekterbarhed, og de har egnede kemiske egenskaber til reproducerbare og robuste eksperimenter. Vi fandt også, at de relevante up-to-date metoder med disse mærkede GnRH-analoger kunne tilbyde roman information om GnRH-baserede drug delivery-systemer. Dette håndskrift indfører nogle enkle og hurtige eksperimenter vedrørende cellulære optagelse af [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II og [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III på EBC-1 (lunge), den BxPC-3 (bugspytkirtlen) og på Detroit-562- (pharynx) ondartet tumor celler. Parallelt med disse GnRH-FITC-konjugater blev cellen overfladeniveau GnRH-I-receptorer også undersøgt på disse cellelinier før og efter GnRH behandling ved konfokal laserscanningsmikroskopi. Den cellulære optagelse af GnRH-FITC-konjugater blev kvantificeret ved fluorescens-aktiveret cellesortering. I disse forsøg blev der observeret mindre forskelle mellem GnRH-analoger og store forskelle mellem celletyper. De signifikante forskelle blandt cellelinjer er korreleret med deres særskilte niveau af celleoverflade GnRH-I-receptorer. De indførte eksperimenter indeholder praktiske metoder til at visualisere, kvantificere og sammenligne optagelsen effektiviteten af GnRH-FITC-konjugater på en tids- og koncentrationsafhængig måde af forskellige adhærente cellekulturer. Disse resultater kunne forudse det stof målrettet effektiviteten af GnRH konjugater på given celle kultur, og tilbyder et godt grundlag for yderligere eksperimenter i undersøgelsen af GnRH-baserede drug delivery-systemer.
Introduction
Peptidbaserede målrettet drug delivery-systemer er blevet en hurtig udviklende og lovende område i kræftbehandling i de seneste par år 1, 2. Menneskelig gonadotropin hormon receptor type I (GnRH-IR) er primært placeret i hypofysen, men er også til stede i flere andre væv, som er ansvarlige for selv-reproduktion 3. GnRH-IR udtrykkes også i en række kræftformer væv, beslægtet eller relateret til reproduktive system 4, 5. Den høje ekspression af GnRH-IR på flere maligne tumorceller sammenlignet med raske væv giver en mulighed for målrettet terapi 5, 6.
Mange gonadotropin-frigivende hormon (GnRH) analoger er blevet udviklet i de seneste årtier, som kunne anvendes som målsøgningsdelef "> 7, 8, 9. Disse peptider er i stand til at levere anticancermidler med høj selektivitet til maligne tumorceller, som overudtrykker GnRH-IR 6. Adskillige GnRH konjugerede anti-tumor lægemidler med højere selektivitet og bedre effektivitet end den tilsvarende ukonjugerede frit lægemiddel er rapporteret 7, 8, 9.
Tidligere publikationer om GnRH peptider og deres receptorer rapporterede, at GnRH-IR kan antage forskellige konformationer, som har forskellig selektivitet for GnRH-analoger 10. Den meget variabel GnRH-IR har komplekse og forskellige signalveje er udstyret med forskellige aktivitet mod deres naturlige og kunstige ligander 11. Disse kendsgerninger gør undersøgelse af GnRH-baserede systemer udfordrende. På den anden side y besidder lovende terapeutisk potentiale. Adskillige forsøg med radiomærkede GnRH peptider blev tidligere rapporteret 12, 13, 14, 15, men forsøg, hvor der blev anvendt fluorescensmærkede GnRH-analoger er stadig begrænset. Mens radioaktiv mærkning giver høj følsomhed, fluorescerende mærkning har flere andre fordele, for eksempel lettere håndtering, og evnen til at modfarvning med forskellige fluoroforer. Tre fælles GnRH-analoger, som har med succes været anvendt til medicinafgivelse er [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II og GnRH-III, men effektiviteten af disse peptider som målretningsgrupper er sjældent sammenlignet 16, 17. På den anden side, følger af separate forsøg, hvor forskellige cancerceller og GnRH-analoger blev brugt er forskelligartet.
ntent "> Ud fra disse overvejelser, fokuserede vi på tumoren målretning og potentielle lægemiddel afgivelse af disse GnRH peptider og derved syntetiseret og karakteriseret [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II og [Lys 8 (FITC)] – GnRH-III peptidkonjugater 18 Disse analoger er selektivt mærket med FITC på sidekæden af deres Lys eller D-Lys (peptid-FITC forholdet 1: 1 ved hver. konjugat). Tanken var, at den selektive fluorescerende mærkning kan tilbyde nye oplysninger om disse peptider, og giver deres gode sporing og pålidelig kvantificering. disse konjugater har sikker håndtering og pålidelig sporbarhed, der gør det lettere at sammenligne deres tumor effektivitet målrettet, og screening af mange typer af maligne tumorceller. Vi håber, at up-to date eksperimenter med disse peptid konjugater kunne bidrage til udviklingen af nye kræft rettet mod GnRH-drug konjugater, og hjælpe med at identificere nye terapeutiske tjærebliver så godt.Den foreliggende manuskript demonstrerer nogle godt reproducerbare og hurtige eksperimenter med GnRH-FITC-konjugater. Celleoverfladeekspression af GnRH-R er en afgørende betingelse om GnRH-optagelse, derfor har vi samtidigt undersøgte celleoverfladen niveau af GnRH-IR på de testede cellelinier. Vi visualiseret GnRH-IR- og GnRH-FITC-konjugater ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) og kvantificeret den cellulære optagelse af GnRH-FITC-konjugater under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimenter beskrevet heri anvender selektivt mærkede GnRH-analoger til screening adhærent cellekulturer in vitro. Konfokal mikroskopi og flowcytometri metoder er egnede til sporing og kvantificering af cellulære optagelse af disse GnRH-FITC-konjugater i et tidsrum og koncentrationsafhængig måde. Disse eksperimenter har følgende kritiske trin: 1) opretholde en steril, sund cellekultur; 2) GnRH-peptider skal være af høj kvalitet; 3) rimelige koncentrationer og inkubationstider skal følges; …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
