الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
تحقيق تجديد محور عصبي بعد إصابة الجهاز العصبي هو مهمة صعبة 1. لدراسة فشل تجديد محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد استخدم الباحثون مجموعة كبيرة من نماذج إصابة العصب. كما تختلف مناطق الجهاز العصبي المركزي، فمن المهم استخدام نموذج مناسب تشريحيا لدراسة تجديد محور عصبي. باستخدام نموذج مناسب، يمكن للباحثين صياغة معاملة محددة بناء على شدة الإصابة، ونوع من الخلايا العصبية في المصالح، والجهاز الشوكي المطلوبة لتقييم تجديد، في مقابل استراتيجية العلاج "واحد للجميع".
في إصابة الحبل الشوكي، على سبيل المثال، أكثر الأعراض المنهكة تنبع من فقدان الإحساس والحركة. ويتسبب فقدان الإحساس الأضرار التي لحقت المسارات الحسية الصاعدة، في حين تسبب في فقدان الحركة الأضرار التي لحقت مسارات السيارات تنازلي. بسبب الاختلافات التشريحية الخلوية وبين هذه TWمسارات س، العديد من الدراسات تجديد محور عصبي المستهدفة تركز فقط على واحد أو الآخر طريقا، مع المنطق القائل الانتعاش الناجح إما أن تكون ذات فائدة كبيرة للمرضى. في هذه المقالة، فإننا نقدم البروتوكول الذي يستخدم الحقن المباشر العقد الجذرية الظهرية (DRG) مع ناقل فيروسي وإصابة سحق الجذرية الظهرية المتزامنة في الحبل الشوكي عنق الرحم أقل من الفئران الكبار كنموذج لدراسة تجديد محور عصبي حسي.
DRG الخلايا العصبية الحسية هي المسؤولة عن نقل المعلومات الحسية، مثل إحساس اللمس والألم، من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي. التوقعات محور عصبي طويلة من الخلايا العصبية الحسية في الحبل الشوكي تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة مسافات طويلة محور عصبي تجديد. وبالإضافة إلى ذلك، كما القوارض يمكن البقاء على قيد الحياة آفة مسار الحسية مثل الإصابة سحق الجذرية الظهرية مع مضاعفات الرعاية الحد الأدنى، يمكن للباحثين دراسة CNS محوار تجديد دون الحاجة إلى الآفة تماما الحبل الشوكي. A C5 الرباعي – C8 (ل عنق الرحموقد تبين 8) الجذر الظهري إصابة سحق لتكون نموذجا مفيدا للforepaw إزالة التدفعات الواردة 2 – إيفل 5. بالإضافة إلى ذلك، يوفر ظهري إصابة سحق جذور نموذجا "أنظف" لدراسة تجديد محور عصبي من إصابة في النخاع الشوكي مباشرة لأن هو غير معقدة من قبل عوامل أخرى مثل تشكيل ندبة الدبقية.
وقد اعتبر استخدام العلاج الجيني الفيروسي لإعادة برمجة الخلايا العصبية في حالة التجدد بشكل متزايد باعتبارها استراتيجية العلاج واعدة للعديد من الحالات العصبية 3. وقد أظهرت الدراسات أن تطبيق متجه فيروس الغدة المرتبطة (AAV) تحمل التحوير من البروتين تعزيز النمو يمكن تحقيق تجديد محور عصبي قوي مع انتعاش السلوكي 4 و 5 و 6. والمرضية انخفاض واضح من AAV في انتزاع استجابة مناعية والقدرة على تنبيغ الخلايا غير قسمة، مثل الخلايا العصبية، وجعلأنه متجه الأمثل للعلاج بالجينات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام النموذج AAV المؤتلف للعلاج. في هذا النموذج، فإنه غير قادر على دمج الجينوم الفيروسي في جينوم المضيف 7، والحد من مخاطر الطفرات إقحامي بالمقارنة مع النواقل الفيروسية الأخرى، مثل الفيروسة البطيئة. وهذا يجعل AAV خيار آمن لتطبيقات العلاج الجيني.
كما يحتوي على DRG الهيئات خلية من الخلايا العصبية الحسية، وهذا هو الهدف التشريحية الأنسب لإدارة فيروس للعلاج بالجينات لدراسة و / أو تشجيع تجديد محور عصبي حسي. في دراسة مقارنة الأنماط المصلية AAV مختلفة والفيروسة البطيئة، وقد أظهرت AAV المصلي 5 (AAV5) لتكون أكثر كفاءة في transducing الخلايا العصبية DRG على مدار الساعة من 12 أسبوعا على الأقل عندما تم حقنها مباشرة في DRG 8. بالإضافة إلى ذلك، يمكن AAV تحقيق أكثر من 40٪ من الكفاءة تنبيغ، transducing جميع أنواع فرعية العصبية DRG، مثل ذات القطر الكبير خيط عصبي 200 كيلو دالتون(NF200) الخلايا العصبية -positive والببتيد المتعلقة الجينات ذات القطر الصغير الكالسيتونين (CGRP) – أو B4 isolectin (IB4) الخلايا العصبية -positive 4 و 8.
كما الإجراء الجراحي لحقن DRG وإصابة سحق الجذرية الظهرية غير الغازية للغاية وحساسة، ونحن نعتقد أن هذه المادة سوف تساعد المستخدمين الجدد لمعرفة الإجراء بطريقة فعالة جدا. في هذه المقالة، وتبين لنا نتائج ممثل من الفئران الكبار بعد أربعة أسابيع من حقن فيروس السيطرة AAV5-GFP (الأخضر بروتين فلوري) في C6 – DRGs C7 مع C5 المتزامنة – C8 الجذرية الظهرية إصابة سحق. هذا النموذج هو مناسبة خاصة للباحثين الذين يحققون في استخدام العلاج الجيني الفيروسي لتعزيز تجديد محور عصبي حسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم دليل خطوة بخطوة لإجراء حقن DRG وإصابة سحق الجذرية الظهرية في الحبل الشوكي عنق الرحم أقل من الفئران الكبار. ولما كان هذا هو جراحة للغاية وحساسة، ونحن نوصي بشدة لكافة المستخدمين المحتملين الحصول على التدريب والممارسة كافية قبل التقدم للعيش جراحة ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مركز البحوث الطبية الحيوية كامبريدج NHMRC كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، ومجلس الأبحاث الطبية، ومجلس الأبحاث الأوروبي ECMneuro، و. ونود أن نعرب عن امتناننا العميق لهيلين ميرل فان 'ر Spijker وجوستينا بارات لتقديم المساعدة التقنية أثناء التصوير. ونود أن نشكر الدكتورة إليزابيث مولوني وأستاذ جوست فيرهاجين (المعهد الهولندي للعلم الأعصاب) للمساعدة في إنتاج AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
