등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
신경계 손상 후 축삭 재생을 달성하는 것은 어려운 과제 일 것입니다. 중추 신경계 (CNS)의 축삭 재생의 실패를 연구하기 위해 연구진은 신경 손상 모델의 과다를 사용했다. 중추 신경계의 지역이 다른, 축삭 재생을 연구하는 해부학 적절한 모델을 사용하는 것이 중요합니다. 해당 모델을 사용함으로써, 연구진은 "1 대 모든"치료 전략에 반대, 부상의 정도, 관심의 신경 세포 유형에 따라 특정 치료 및 재생을 평가하기위한 원하는 척추 기관을 공식화 할 수 있습니다.
척수 손상에서, 예를 들어, 대부분의 쇠약 증상은 감각과 운동의 손실에서 줄기. 운동의 손실이 하강 모터 경로의 손상에 의해 발생하는 동안 감각의 손실이 상승하는 감각 경로의 손상에 의해 발생합니다. 때문에 이러한 TW 사이의 셀룰러 및 해부학 적 차이O 경로, 많은 대상 축삭 재생 연구는 단지 하나의 성공적인 회복이 환자들에게 엄청난 도움이 될 것이라는 점을 근거로, 하나 개 또는 다른 경로에 초점을 맞 춥니 다. 이 글에서, 우리는 바이러스 성 벡터와 감각 축삭 재생을 연구하는 모델로 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 동시 후근 호감 부상으로 직접 후근 신경절 (DRG) 주입을 사용하는 프로토콜을 제시한다.
DRG 감각 뉴런은 CNS에 주변에서, 같은 촉감과 통증 감각 정보를 중계 할 책임이 있습니다. 척수 감각 뉴런의 긴 축삭 돌기 장거리 축삭 재생을 연구하는 좋은 모델이 될. 또한, 설치류 등 최소한의 복지 합병증 지느러미 루트 압박 손상으로 감각 경로의 병변에서 살아남을 수있는, 연구진은 완전히 척수 병변 할 필요없이 CNS 축삭 재생을 공부할 수 있습니다. 사중의 C5 – C8 (자궁 리터레벨 레벨 5-8) 등의 루트 압박 손상은 앞발의 deafferentation 2에 유용한 모델이 될 것으로 나타났다. 또한, 지느러미 루트 압박 손상은이 같은 폐해 흉터 형성과 같은 다른 요인에 의해 복잡하기 때문에 직접 척수 손상보다 축삭 재생을 연구하는 "깨끗한"모델을 제공합니다.
회생 상태 뉴런 재 프로그램 바이러스 유전자 요법의 사용이 점점 더 많은 신경 학적 조건 3 유망한 치료 전략으로 간주되어왔다. 연구 행동 복구 4,5,6 견고한 축삭 재생을 달성 할 수있는 성장 촉진 단백질의 유전자를 나르는 아데노 – 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 적용을 도시 하였다. 면역 반응과 같은 뉴런 비 분열 세포를 형질 도입하는 능력을 유도의 AAV의 명백한 낮은 병원성이 만들어그 유전자 치료에 대한 최적의 벡터. 또한, AAV 재조합 형태는 치료에 사용된다. 이 형태에서는, 숙주 게놈 내로는 7 바이러스 게놈 통합 예컨대 렌티 바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터에 비해 삽입 성 돌연변이 유발의 위험을 줄일 수없는 것이다. 이것은 AAV 유전자 치료 응용 프로그램을위한 안전한 선택을합니다.
DRG 감각 뉴런의 세포 기관을 포함, 연구 및 / 또는 감각 축삭의 재생을 촉진하는 유전자 치료에 대한 바이러스의 관리를위한 가장 적절한 해부학 적 대상입니다. 다른 AAV 혈청 형 및 렌티 바이러스를 비교 한 연구에서는 AAV 혈청 형 5의 (AAV5)는 DRG (8)에 직접 주입 할 때 적어도 12 주 시간 코스 위에 DRG 신경 세포를 형질 도입에서 가장 효율적인 것으로 나타났다. 또한, AAV는 대경 신경 미세 섬유 200 kDa의 모든 아형 DRG 신경 세포를 형질 도입, 40 % 이상 전달 효율을 얻을 수있다(NF200) 양성 뉴런 소경 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) – 또는 동종 렉틴 B4 (IB4) 양성 뉴런 4, 8.
DRG 주입 및 후근 압박 손상의 수술로 매우 침략하고 섬세한, 우리는이 문서가 새로운 사용자는 매우 효율적인 방식으로 절차를 학습하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. C8 등의 루트 압박 손상 – 동시 C5와 C7의 DRGs -이 문서에서 우리는 성인 사주 C6로 제어 바이러스 AAV5-GFP (녹색 형광 단백질)의 주입 후 쥐에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 모델은 감각 축삭의 재생을 촉진하는 바이러스 성 유전자 치료의 사용을 조사하고 연구에 특히 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 DRG 주입 및 후근 압박 손상을 수행하는 단계별 가이드를 제시한다. 이것은 매우 침략하고 섬세한 수술이기 때문에, 우리는 강력하게 모든 잠재적 인 사용자가 동물 수술을 살기를 진행하기 전에 충분한 훈련과 연습을받는 것이 좋습니다. 사용자는 척수의 해부학뿐만 아니라 주변의 근육 조직, 척추 뼈 구조, 그리고 혈관에뿐만 아니라 잘 알고…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크리스토퍼와 다나 리브 재단, 의학 연구위원회 (Medical Research Council), 유럽 연구위원회 ECMneuro 및 캠브리지 NHMRC 생물 의학 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 촬영하는 동안 자신의 기술 지원을 헬린 메렐 반 't Spijker 및 저스티나 바렛에 깊은 감사의 말씀을드립니다. 우리는 AAV 생산 지원을 위해 박사 엘리자베스 몰 로니 교수 유스트 버헤건 (신경 과학을위한 네덜란드 연구소) 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
