Спинальный ганглий Injection и дорсальных корешков размозжение как модель для регенерации Сенсорное Axon
Summary
This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.
Abstract
Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.
Introduction
Достижение регенерации аксонов после травмы нервной системы является сложной задачей 1. Изучить отказ регенерации аксонов в центральной нервной системе (ЦНС), исследователи использовали множество моделей травмы нерва. В области центральной нервной системы отличаются, важно использовать анатомически подходящую модель для изучения регенерации аксонов. Используя соответствующую модель, исследователи могут сформулировать конкретное лечение, основанное на степени тяжести травмы, нейронного типа клеток, представляющих интерес, и желаемый спинномозговой тракт для оценки регенерации, в отличие от стратегии лечения «один-для-всех».
В травмы спинного мозга, например, наиболее изнурительных симптомы обусловлены потерей ощущения и передвижения. Потеря чувствительности вызвана повреждением восходящих чувствительных путей, в то время как потеря локомоции вызвана повреждением нисходящих двигательных путей. Благодаря сотовой связи и анатомических различий между этими ТВтО пути, многие целевые исследования регенерации аксонов сосредоточиться только на одном или другом пути, с обоснованием, что успешное восстановление либо имело бы огромную пользу пациентам. В этой статье мы приводим протокол, который использует прямую спинную ганглии (DRG) инъекцию с вирусным вектором с одновременным спинномозговым размозжение в нижнем шейном отделе спинного мозга взрослой крысы в качестве модели для изучения сенсорной регенерации аксонов.
DRG сенсорные нейроны отвечают за передачу сенсорной информации, например, тактильного ощущения и боли, от периферии к ЦНС. Длинная аксональная проекция сенсорных нейронов в спинном мозге служит хорошей моделью для изучения на дальних расстояния аксонов регенерации. Кроме того, как грызуны могут выжить сенсорное поражение тропинки, такие как размозжение спинномозговых с минимальными осложнениями благосостояния, исследователи могут изучать ЦНС аксоны регенерации без необходимости полностью поражения спинного мозга. Четверку С5 – С8 (шейный лEvel 5 – 8) дорсальных корешков размозжение было показано, что полезная модель для передней лапы деафферентации 2. Кроме того, спинные травмы корня раздавить обеспечивает модель «чистую» для изучения регенерации аксонов, чем прямое повреждение спинного мозга, так как он неосложненный другими факторами, таких как образование глиальных рубцов.
Использование вирусной генной терапии перепрограммировать нейроны в генераторном режиме все чаще рассматривается в качестве перспективного стратегии лечения для многих неврологических заболеваний 3. Исследования показали , применение в адено-ассоциированный вирус (AAV) вектора , несущего трансген белка стимулирующие рост может достичь надежной регенерации аксонов с поведенческой восстановления 4, 5, 6. Очевидно низкое патогенность AAV в индукции иммунного ответа и способность передавать не-делящиеся клетки, такие как нейроны, сделатьэто оптимальный вектор для генной терапии. Кроме того, рекомбинантная форма ААВ используется для терапии. В таком виде он не способен интегрировать его вирусный геном в геном хозяина 7, снижая риск инсерционного мутагенеза по сравнению с другими вирусными векторами, такие как лентивирусы. Это делает AAV безопасным выбором для генной терапии.
Как DRG содержит клеточные тела чувствительных нейронов, является наиболее подходящей мишенью для анатомического введения вируса для генной терапии для изучения и / или способствовать сенсорную регенерации аксонов. В сравнительном исследовании различных серотипов AAV и лентивирус, AAV серотипа 5 (AAV5) было показано, что наиболее эффективным в трансдукции DRG нейроны в течение времени течение по крайней мере 12 недель при введении непосредственно в DRG 8. Кроме того, ААВ может достичь более 40% эффективности трансдукции, трансдукции всех нейрональных подтипов DRG, таких как нейрофиламенты большого диаметра 200 кД(NF200) -положительные нейроны и кальцитонин малого диаметра , связанный с геном пептид (CGRP) – или isolectin b4 (IB4) -положительные нейроны 4, 8.
В хирургической процедуры DRG инъекции и спинномозговых размозжение чрезвычайно агрессивен и деликатная, мы считаем, что эта статья поможет новым пользователям узнать процедуру в очень эффективной манере. В этой статье мы покажем, репрезентативные результаты от взрослых крыс через четыре недели после инъекции вируса управления AAV5-GFP (зеленый флуоресцентный белок) в C6 – C7 КСГ с одновременным C5 – C8 дорсальных корешков размозжение. Эта модель особенно подходит для исследователей, изучающих использование вирусной генной терапии для содействия сенсорной регенерации аксонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем руководство шага за шагом, чтобы выполнить инъекцию DRG и спинной корень размозжение в нижнем шейном отделе спинного мозга взрослого крысы. Поскольку это чрезвычайно агрессивна и тонкая операция, мы настоятельно рекомендуем, чтобы все потенциальные пользо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Кристофера и Даны Рив Фонда, Медицинского исследовательского совета, Европейского исследовательского совета ECMneuro и научно-исследовательский центр Cambridge NHMRC Biomedical. Мы хотели бы выразить нашу глубокую благодарность Хелин Мерел фургон «т Spijker и Юстина Барратт за техническую помощь во время съемок. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Элизабет Молони и профессор Джоост Верхааген (Нидерландский институт Neuroscience) для оказания помощи в производстве AAV.
Materials
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
