激光局部补骨脂素加合物的单分子分析
Summary
激光器在对DNA损伤的细胞应答的研究经常使用的。然而，它们产生的病变，其间隔，频率，和碰撞与复制叉很少表征。在这里，我们描述了一种方法，使这些参数与激光局部间交联的决心。
Abstract
DNA损伤反应（DDR）已经被广泛表征在活细胞中诱导激光微束照射的双链断裂（DSB的）的研究。该DDR到螺旋扭曲共价DNA修饰，包括链间交联的DNA（的ICL），没有作为很好的界定。我们研究通过的ICL刺激DDR，通过immunotagged补骨脂素的光敏激光定位，在活细胞中的细胞核。为了解决约加成分布和复制叉遇到的基本问题，我们结合与其他两种技术的激光定位。 DNA纤维经常用于显示通过在短的脉冲掺入核苷类似物的免疫荧光的复制叉的进展。 Immunoquantum点已被广泛用于单分子成像。在新方法中，从携带激光局部的ICL细胞DNA的纤维铺在显微镜载玻片上。该标记的ICL显示有immunoquantum点和日电子病变间距离来确定。复制叉的碰撞与的ICL可以可视化和不同遭遇的图案识别和定量。
Introduction
DNA是从下外源性试剂如辐射，紫外线，环境毒素，燃烧产物，等。此外，还通过氧化代谢产生的内源性自由基物种攻击恒定攻击。所有这些必须化学或物理破坏DNA的完整性1的潜力。在基因组扰动可以激活DNA损伤反应（DDR），招聘和翻译后修饰级联数百，甚至数千名参与损伤修复蛋白和微RNA，细胞周期，细胞凋亡，衰老和炎症通路的调控2。
大多数的我们对DDR的信息来自于与DNA双链断裂的研究。这在很大程度上是由于技术在活细胞中导入3断裂，包括序列特异性断裂，在基因组DNA的可用性。此外，propensit断裂的y以诱导蛋白质DDR，这可以通过免疫荧光来显示的病灶，已经非常有帮助，用于识别的动力学和响应蛋白质的要求。一个用于研究DDR的关键技术是由邦纳和他的同事，谁在活细胞4的核使用激光束直接DNA双链断裂的条纹在“利益区域”（ROI）推出。实际上，他们创造了一个漫长的焦点，其中DDR的蛋白质可以通过免疫识别。这是由它们的磷酸化组蛋白H2AX的激光暴露的细胞的强条带（γ-H2AX）的示范说明。此后，激光方法已通过DNA双链断裂引起的DDR的众多研究中。虽然功能强大和流行，和戏剧性的免疫荧光图像的来源，应该指出的是，在大多数实验的激光强度进行调整，从而产生可观察到的结果，而对病变身份的关注，密度，或间距。事实上，它可能很难做这类估算。因此，它们在很大程度上忽略了，尽管由激光器5引入DNA损伤的多重性。这有助于在文献6的许多矛盾。
与此相反，以双链断裂，DNA的大多数化学修饰不刺激DDR蛋白质的分离的焦点的形成。这是我们目前的病变频率的理解之光重要的。据估计，在培养的人细胞招致每个细胞周期多达50双链断裂，在S期7，8，9很大程度上形成。形成在非增殖细胞更少。与此相反，核碱基丢失或修改事件，这是在数万每细胞/ 1天，10的数目。因此，我们最大约知道通过比较少见，而那些通过螺旋扭曲病变，合共更为常见诱发少得多的事件引起的DDR。
为了解决有关的细胞反应共价基因组DNA的修改问题，我们希望具有螺旋扭曲的DNA加合物是有内在的DDR诱导活性的工作。此外，为了方便实验设计和解释，我们感兴趣的是其引入可能对于控制时间，是适合于可视化的结构。因此，我们开发了基于补骨脂素的战略。补骨脂素被很好地表征光敏DNA嵌入有利于5' TA：AT网站。不像其他的交联剂如氮芥和丝裂霉素C（MMC）它们不是DNA的反应性，除非暴露于长波紫外光（UVA）光。插层的分子与相反链上，以产生螺旋扭曲间交联胸腺嘧啶碱基（的ICL反应）11。在我们的实验中使用的三甲基补骨脂素大多数产品都是的ICL，相对少的单加成物产生（低于10％）12，以及在一条链上相邻碱基之间的内交联不形成。因为他们是强大的块复制和转录，补骨脂等交联剂，如顺铂和MMC，通常用于化疗。因此补骨脂启用研究，通过一个螺旋扭曲结构跟着DDR的激活，并且还提供了洞察到与临床重要性的化合物的细胞应答。
我们合成，其中三甲基补骨脂素是有联系的地高辛（DIG）的试剂，植物甾醇未在哺乳动物细胞中发现的，并经常用作immunotag。用于光活化的要求在活细胞中的细胞核定位允许通过补骨脂素的ICL在定义的ROI的激光（365纳米）。这些可以通过IMM显示unofluorescence反对挖标签。 DNA修复和DDR蛋白出现在激光的局部的ICL 13,14的条纹。
通过用于产生双链断裂的高激光强度激活DDR可能是由于分离的或聚集损伤15,16。因此，从这些实验结果的相关性，以天然存在的病变，本在低得多的浓度，是不确定的。为了解决有关的DNA加合物补骨脂频率和间距类似的问题，我们利用DNA纤维技术17和immunoquantum点。量子点是比荧光染料更明亮，没有被曝光漂白光。因此，它们经常用于单分子成像18，一个应用程序，其为荧光染料是不够明亮。个人DNA纤维可以上克被拉伸小姑娘滑动，并且可以通过对在细胞收获前的温育过程中掺入的核苷类似物免疫荧光来显示。我们处理的细胞与地高辛补骨脂素和露出的ROI，以激光微照射。纤维从细胞和个体辛补骨脂素加合物准备可以与immunoquantum点进行可视化。将细胞暴露于核苷类似物为相对短的时间（20-60分钟）允许复制大片在激光局部的ICL的附近的显示。
Protocol
Representative Results
Discussion
激光定位技术要求与在明亮的视野显微镜可见细胞核使用贴壁细胞。我们已经试图附加非贴壁细胞，如初级淋巴细胞，或松散粘连培养细胞如AD293，与细胞粘附制剂，如聚赖氨酸或胶原，或更复杂的混合物在玻璃表面。虽然这些治疗方法可以将细胞结合到表面，我们发现，他们一般留圆角使其很难集中到细胞核。此外，细胞通常不能存活除去生长培养基后的初始洗涤。然而，对于贴壁细胞的要求?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究部分由美国国立卫生研究院，研究所院内研究老龄问题方案（Z01 AG000746-08）和范可尼贫血研究基金的支持。
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
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