Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits
Summary
Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.
Abstract
L'ADN réponse aux dommages (DDR) a été largement caractérisé en études de cassures double brin (CDB) induit par micro irradiation par faisceau laser dans les cellules vivantes. Le DDR à l'hélice de distorsion modifications de l'ADN covalentes, y compris des reticulations entre brins d'ADN (ICL), ne sont pas aussi bien définie. Nous avons étudié la DDR stimulée par ICL, localisée par photoactivation laser de psoralènes immunotagged, dans les noyaux des cellules vivantes. Afin de répondre à des questions fondamentales sur la distribution de produits d'addition et de rencontres de la fourche de réplication, nous avons combiné la localisation laser avec deux autres technologies. des fibres d'ADN sont souvent utilisés pour afficher la progression des fourches de réplication par immunofluorescence d'analogues nucléosidiques incorporés pendant de courtes impulsions. points Immunoquantum ont été largement utilisés pour l'imagerie seule molécule. Dans la nouvelle approche, les fibres d'ADN de cellules portant ICL localisée au laser sont étalées sur des lames de microscope. Les ICL marqués sont affichés avec des points de immunoquantum et ee distances inter-lésion déterminée. les collisions de la fourche de réplication avec ICL peuvent visualiser et différents modèles de rencontre identifiés et quantifiés.
Introduction
ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l'intégrité de l' ADN 1. Perturbations dans le génome peut activer l'ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la sénescence et les voies inflammatoires 2.
La plupart de nos informations sur le DDR proviennent d'études avec DSB. Cela est en grande partie en raison de la disponibilité des technologies pour l' introduction de pauses, y compris les pauses spécifiques de séquence, dans l' ADN génomique dans les cellules vivantes 3. De plus, le propensity des pauses pour induire des foyers de protéines DDR, qui peuvent être affichés par immunofluorescence, a été très utile pour identifier la cinétique et les exigences des protéines répondant. L' une des technologies clés pour l' étude de la DDR a été présenté par Bonner et ses collègues, qui ont utilisé un faisceau laser pour diriger une bande de DSB dans une « région d'intérêt » (ROI) dans les noyaux des cellules vivantes 4. En effet, ils ont créé un foyer long dans lequel les protéines de la DDR pourraient être identifiés par immunofluorescence. Cela a été illustré par la démonstration de la bande forte de l'histone H2AX phosphorylée (γ-H2AX) dans les cellules exposées au laser. Depuis lors, l'approche laser a été utilisé dans de nombreuses études de la DDR induites par DSB. Bien que puissant et populaire, et la source d'images dramatiques immunofluorescence, il convient de noter que, dans la plupart des expériences l'intensité du laser est ajustée de manière à produire des résultats observables, sans se soucier de l'identité de la lésion,la densité, ou l'espacement. En effet, il peut être difficile de faire ces estimations. Ainsi , ils sont largement ignorés, malgré la multiplicité des lésions introduites dans l' ADN par des lasers 5. Cela contribue aux nombreuses contradictions dans la littérature 6.
Contrairement aux DSB, la plupart des modifications chimiques de l'ADN ne stimulent pas la formation de foyers discrets de protéines DDR. Ceci est important à la lumière de notre compréhension actuelle des fréquences de lésion. Il a été estimé que les cellules humaines en culture subissent moins de 50 DSB par cycle cellulaire, en grande partie formés au cours de la phase S 7, 8, 9. Moins sont formées dans des cellules non proliférantes. Cela contraste avec le nombre de pertes de nucléobases ou des événements de modification, qui sont des dizaines de milliers par cellule / jour 1, 10. Nous savons donc le plusle DDR induite par des événements qui sont relativement rares, et beaucoup moins sur celles qui sont induites par des lésions des effets de distorsion de l'hélice, ce qui, au total, sont beaucoup plus fréquents.
Afin de répondre à des questions sur la réponse cellulaire à covalentes modifications de l'ADN génomique, nous voulions travailler avec un produit d'addition d'ADN de distorsion d'hélice qui avait inhérente l'activité d'induction de DDR. De plus, pour faciliter la conception expérimentale et l'interprétation que nous étions intéressés par une structure dont l'introduction pourrait être contrôlée par rapport au temps et était prête à la visualisation. Par conséquent, nous avons développé une stratégie basée sur psoralène. Les psoralènes sont bien caractérisés intercalants d'ADN favorisant photoactifs 5' TA: AT sites. Contrairement à d'autres agents de reticulation tels que les moutardes d'azote et de la mitomycine C (MMC), ils ne sont pas l'ADN réactif à moins exposé aux UV onde longue (UVA). Les molécules intercalées réagissent avec les bases thymine sur des brins opposés pour produire des reticulations entre brins de distorsion d'hélice (CIST) 11. Avec le psoralène triméthyl utilisé dans nos expériences la plupart des produits sont ICL, relativement peu monoadducts sont générés (moins de 10%) 12 et des réticulations entre les bases intrabrin adjacentes sur un brin ne sont pas formés. Parce qu'ils sont des blocs puissants à la réplication et la transcription, psoralène et d'autres agents de réticulation, comme le cis-platine et MMC, sont couramment utilisés en chimiothérapie. Ainsi psoralène permis d'études qui ont suivi l'activation du DDR par une structure de distorsion de l'hélice, et a également fourni un aperçu de la réponse cellulaire à un composé ayant une importance clinique.
Nous avons synthétisé un réactif dans lequel psoralène triméthyl était lié à la digoxigénine (Dig), un stérol végétal ne se trouve pas dans les cellules de mammifères et souvent utilisé comme immunotag. L'exigence de photoactivation permet la localisation par la lumière laser (365 nm) de psoralène CIST en ROI défini dans les noyaux dans des cellules vivantes. Ceux-ci peuvent être affichés par immunofluorescence contre l'étiquette Dig. Réparation de l' ADN et des protéines DDR est apparu dans les bandes de laser localisés ICL 13, 14.
Le DDR activé par les fortes intensités de laser utilisées pour produire des DSB peut être dû à des dommages isolés ou regroupés 15, 16. Par conséquent, la pertinence des résultats de ces expériences à des lésions d'origine naturelle, présente une concentration beaucoup plus basse, est incertain. Pour répondre à des questions similaires sur la fréquence des produits d'addition psoralène et l' espacement dans l' ADN, nous avons profité de la technologie de fibre d'ADN 17 et des points de immunoquantum. Les points quantiques sont beaucoup plus lumineux que les colorants fluorescents et ne sont pas blanchies par exposition à la lumière. Ainsi , ils sont fréquemment utilisés pour l' imagerie de la molécule unique 18, une application pour laquelle les colorants fluorescents sont pas suffisamment brillante. fibres d'ADN individuelles peuvent être étirées sur gdiapositives lass et peuvent être affichées par immunofluorescence contre analogues nucléosidiques incorporés au cours incubations avant la récolte des cellules. Nous avons traité les cellules avec Dig-psoralène et le retour sur investissement exposés à une irradiation par micro laser. Les fibres ont été préparées à partir des cellules et des produits d'addition individuels Dig-psoralène peut être visualisée avec les points de immunoquantum. Exposer les cellules à des analogues nucléosidiques pendant des durées relativement courtes (20-60 min) permet l'affichage des voies de réplication dans le voisinage de la CIST localisée au laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technologie de localisation laser nécessite l'utilisation de cellules adhérentes avec des noyaux qui sont visibles en microscopie en champ clair. Nous avons essayé de fixer les cellules non adhérentes, telles que les lymphocytes primaires, ou des cellules cultivées faiblement adhérentes telles que AD293, à la surface du verre avec des préparations adhésives des cellules tels que la polylysine ou de collagène, ou des mélanges plus complexes. Bien que ces traitements peuvent lier les cellules à la surfa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, l'Institut national sur le vieillissement (Z01 AG000746-08) et le Fonds de recherche anémie de Fanconi.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
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