लेजर स्थानीयकृत Psoralen adducts की एकल अणु विश्लेषण
Summary
लेजर अक्सर डीएनए की क्षति के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के अध्ययन में किया जाता है। हालांकि, वे घावों जिसका रिक्ति, आवृत्ति, और टकराव से प्रतिकृति कांटे के साथ शायद ही कभी विशेषता है उत्पन्न करते हैं। यहाँ, हम एक दृष्टिकोण है कि लेजर स्थानीय interstrand crosslinks के साथ इन मानकों के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है का वर्णन।
Abstract
डीएनए नुकसान की प्रतिक्रिया (डीडीआर) बड़े पैमाने पर डबल भूग्रस्त टूटता (DSBs) जीवित कोशिकाओं में लेजर सूक्ष्म बीम विकिरण से प्रेरित के अध्ययन में बताया गया है। डीडीआर interstrand डीएनए crosslinks (ICLs) सहित सहसंयोजक डीएनए संशोधनों, विकृत हेलिक्स के लिए, साथ ही परिभाषित नहीं है। हम डीडीआर ICLs द्वारा प्रेरित, immunotagged psoralens की लेजर photoactivation के द्वारा स्थानीय अध्ययन किया है, जीवित कोशिकाओं के नाभिक में। आदेश अभिवर्तन वितरण और प्रतिकृति कांटा मुठभेड़ों बारे में बुनियादी सवालों को संबोधित करने के लिए, हम दो अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ लेजर स्थानीयकरण संयुक्त। डीएनए फाइबर अक्सर कम दालों के दौरान शामिल किया न्यूक्लीओसाइड analogues की इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रतिकृति कांटे की प्रगति प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Immunoquantum डॉट्स व्यापक रूप से एक अणु इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है। नए दृष्टिकोण में, लेजर स्थानीय ICLs ले जाने कोशिकाओं से डीएनए फाइबर खुर्दबीन स्लाइड पर फैले हुए हैं। टैग ICLs immunoquantum डॉट्स और वें के साथ प्रदर्शित किए जाते हैंई अंतर-घाव दूरी निर्धारित। ICLs साथ प्रतिकृति कांटा टकराव देखे जा सकते हैं और विभिन्न मुठभेड़ पैटर्न की पहचान की और quantitated।
Introduction
डीएनए विकिरण, पराबैंगनी प्रकाश, पर्यावरण के विषैले तत्वों, दहन उत्पाद, आदि इसके अतिरिक्त, यह भी अंतर्जात कट्टरपंथी ऑक्सीडेटिव चयापचय के द्वारा उत्पन्न प्रजातियों के द्वारा हमला किया जाता है के रूप में exogenous एजेंटों से लगातार हमले के अंतर्गत है। इन सभी संभावित रासायनिक या शारीरिक रूप से डीएनए 1 की अखंडता को बाधित करने के लिए है। जीनोम में अव्यवस्थाएं, डीएनए नुकसान की प्रतिक्रिया (डीडीआर), एक भर्ती और बाद अनुवादकीय संशोधन झरना सैकड़ों के साथ सक्रिय कर सकते हैं प्रोटीन और microRNAs घाव की मरम्मत में शामिल के हजारों यदि नहीं, तो, कोशिका चक्र, apoptosis, बुढ़ापा, और भड़काऊ रास्ते में से विनियमन 2।
डीडीआर बारे में हमारी जानकारी के अधिकांश DSBs के साथ अध्ययन से आता है। यह जीवित कोशिकाओं 3 में टूट जाता है शुरू, अनुक्रम विशिष्ट निकालने सहित, जीनोमिक डीएनए में के लिए प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता की वजह से बड़े हिस्से में है। इसके अलावा, propensitटूट के y डीडीआर प्रोटीन है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता की फोकी प्रेरित करने के लिए, गतिकी और जवाब प्रोटीन की आवश्यकताओं की पहचान करने के लिए बहुत उपयोगी है। डीडीआर के अध्ययन के लिए कुंजी प्रौद्योगिकियों में से एक बोनर और उनके सहयोगियों ने (आरओआई) जीवित कोशिकाओं 4 के नाभिक में एक लेजर बीम का इस्तेमाल किया एक "रुचि के क्षेत्र" में DSBs की एक पट्टी को निर्देशित करने के द्वारा शुरू की गई थी। वास्तव में, वे एक लंबी फोकस जिसमें डीडीआर के प्रोटीन इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पहचाना जा सकता है बनाया। इस मजबूत फॉस्फोरिलेटेड हिस्टोन H2AX की लेजर उजागर हुई कोशिकाओं में (γ-H2AX) पट्टी के अपने प्रदर्शन के रूप में रेखांकित किया गया था। तब से, लेजर दृष्टिकोण DSBs से प्रेरित डीडीआर के कई अध्ययन में प्रयुक्त किया गया है। हालांकि शक्तिशाली और लोकप्रिय है, और नाटकीय इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों का स्रोत है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सबसे प्रयोगों में लेजर तीव्रता निकाला जाता है तो के रूप में नमूदार परिणाम पाने के लिए, घाव पहचान के लिए चिंता का विषय के बिना,घनत्व, या रिक्ति। वास्तव में, यह इन अनुमानों बनाने के लिए मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार वे काफी हद तक नजरअंदाज कर दिया जाता लेज़रों 5 से डीएनए में पेश घावों की बहुलता के बावजूद। यह साहित्य 6 में कई विरोधाभास योगदान देता है।
DSBs के विपरीत, डीएनए के सबसे रासायनिक संशोधनों डीडीआर प्रोटीन की असतत फोकी के गठन को प्रोत्साहित नहीं करते। यह घाव आवृत्तियों की हमारी वर्तमान समझ के प्रकाश में महत्वपूर्ण है। ऐसा अनुमान है कि संस्कृति में मानव कोशिकाओं कोशिका चक्र के अनुसार 50 DSBs, एस चरण 7, 8, 9 के दौरान बड़े पैमाने पर गठन उठाना। कम गैर proliferating कोशिकाओं में बनते हैं। यह nucleobase नुकसान या संशोधन की घटनाओं, जो सेल / दिन 1, 10 प्रति हजारों में हैं की संख्या के विपरीत है। इस प्रकार, हम के बारे में सबसे पताडीडीआर घटनाओं अपेक्षाकृत दुर्लभ है, और हेलिक्स विकृत घावों, जो कुल में कहीं अधिक आम हैं से प्रेरित उन के बारे में बहुत कम कर रहे हैं से प्रेरित।
आदेश सेलुलर प्रतिक्रिया जीनोमिक डीएनए के संशोधनों सहसंयोजक के बारे में प्रश्नों का उत्तर देने के लिए, हम एक हेलिक्स विकृत डीएनए अभिवर्तन कि निहित डीडीआर प्रेरण गतिविधि था के साथ काम करना चाहता था। इसके अलावा, प्रयोगात्मक डिजाइन की सुविधा के लिए और व्याख्या हम एक संरचना जिसका परिचय समय के संबंध में नियंत्रित किया जा सकता और दृश्य के लिए उत्तरदायी था में रुचि रखते थे। तदनुसार, हम psoralen के आधार पर एक रणनीति विकसित की है। स्थलों पर: Psoralens अच्छी तरह से पक्ष 5 'टीए प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित डीएनए intercalators विशेषता है। जैसे नाइट्रोजन सरसों और mitomycin सी (एमएमसी) वे डीएनए प्रतिक्रियाशील जब तक लंबे लहर यूवी (यूवीए) प्रकाश के संपर्क में नहीं हैं के रूप में अन्य crosslinking एजेंट के विपरीत। intercalated अणुओं विपरीत किस्में हेलिक्स विकृत interstrand crosslinks का उत्पादन करने पर थाइमिन अड्डों (ICLs के साथ प्रतिक्रिया) 11। Trimethyl हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया psoralen के साथ अधिकांश उत्पादों ICLs, अपेक्षाकृत कुछ monoadducts उत्पन्न कर रहे हैं (कम से कम 10%) 12, और एक किनारा पर आसन्न बेस के बीच intrastrand crosslinks का गठन नहीं कर रहे हैं। क्योंकि वे प्रतिकृति और प्रतिलेखन, psoralen और अन्य crosslinking एजेंट, सिस-प्लेटिनम और एमएमसी की तरह करने के लिए शक्तिशाली खंड हैं, आमतौर पर कीमोथेरेपी में किया जाता है। इस प्रकार psoralen सक्षम अध्ययन है कि एक हेलिक्स विकृत संरचना द्वारा डीडीआर की सक्रियता पीछा किया, और भी नैदानिक महत्व के साथ एक यौगिक के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान की है।
हम एक अभिकर्मक जिसमें trimethyl psoralen Digoxigenin को (खुदाई) से जुड़ा हुआ था संश्लेषित, एक संयंत्र स्टेरोल स्तनधारी कोशिकाओं में नहीं मिला है और अक्सर एक immunotag रूप में इस्तेमाल किया। photoactivation के लिए आवश्यकता जीवित कोशिकाओं में नाभिक में परिभाषित लागत पर लाभ में psoralen ICLs की लेजर प्रकाश (365 एनएम) द्वारा स्थानीयकरण अनुमति देता है। ये IMM द्वारा प्रदर्शित किया जा सकताखुदाई टैग के खिलाफ unofluorescence। डीएनए की मरम्मत और डीडीआर प्रोटीन लेजर की धारियों स्थानीय ICLs 13, 14 में दिखाई दिया।
डीडीआर DSBs का उत्पादन किया जाता उच्च लेजर तीव्रता से सक्रिय पृथक या क्लस्टर क्षति 15, 16 की वजह से हो सकता है। नतीजतन, इन प्रयोगों से परिणाम की प्रासंगिकता स्वाभाविक रूप से घावों, वर्तमान में काफी कम एकाग्रता होने वाली है, अनिश्चित है। Psoralen अभिवर्तन आवृत्ति और डीएनए में अंतर के बारे में इसी तरह के सवाल करने के लिए, हम डीएनए फाइबर प्रौद्योगिकी 17 और immunoquantum डॉट्स का फायदा उठाया। क्वांटम डॉट्स फ्लोरोसेंट रंजक की तुलना में बहुत उज्जवल हैं और प्रकाश के संपर्क से प्रक्षालित नहीं हैं। इस प्रकार वे अक्सर एक अणु इमेजिंग 18 के लिए उपयोग किया जाता है, एक आवेदन जिसके लिए फ्लोरोसेंट रंजक अपर्याप्त चमकदार हैं। व्यक्तिगत डीएनए फाइबर ग्राम पर फैला किया जा सकता हैलड़की स्लाइड और फसल सेल से पहले incubations के दौरान शामिल किया न्यूक्लीओसाइड analogues के खिलाफ immunofluorescence द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता। हम खुदाई-psoralen के साथ कोशिकाओं का इलाज किया और लेजर सूक्ष्म विकिरण करने के लिए लागत पर लाभ से अवगत कराया। फाइबर कोशिकाओं और व्यक्तिगत खुदाई-psoralen adducts से तैयार किए गए immunoquantum डॉट्स के साथ देखे जा सकते थे। कोशिकाओं को उजागर अपेक्षाकृत कम बार (20-60 मिनट) के लिए analogues न्यूक्लीओसाइड लिए लेजर स्थानीय ICLs के आसपास के क्षेत्र में प्रतिकृति इलाकों के प्रदर्शन की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लेजर स्थानीयकरण प्रौद्योगिकी नाभिक कि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में दिखाई दे रहे हैं के साथ पक्षपाती कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता है। हम इस तरह polylysine या कोलेजन, या अधिक जटिल मिश्रण के रूप में सेल ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एजिंग (Z01 AG000746-08) और Fanconi एनीमिया रिसर्च फंड पर एनआईएच, राष्ट्रीय संस्थान के अंदर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित किया गया।
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
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