В методах Vitro для сравнения цели связывания и CDC Индукционные Между терапевтических антител применения в анализе Biosimilarity
Summary
Этот протокол описывает in vitro сравнение двух ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: связывание с мишенью и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Методы были использованы для сравнения между эталонным ритуксимабом и биоподобным ритуксимабом. Эти анализы можно использовать во время биоподобного развития или в качестве контроля качества в их производстве.
Abstract
Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) имеют отношение к лечению различных патологий, включая раковые образования. Разработка биоподобных mAb фармацевтическими компаниями – это рыночная возможность, но это также стратегия увеличения доступности лекарств и снижения затрат, связанных с терапией. Протоколы, подробно описанные здесь, описывают оценку связывания мишеней и индукцию CDC ритуксимабом в клетках Daudi. Эти две функции требуют различных структурных областей антитела и имеют отношение к клиническому эффекту, индуцированному ритуксимабом. Протоколы позволяют проводить параллельное сравнение эталонного ритуксимаба и биодоступного ритуксимаба. Оцененные продукты демонстрировали различия как в связывании с мишенью, так и в индукции CDC, предполагая, что существуют фундаментальные физико-химические различия и подчеркивается необходимость анализа влияния этих различий в клинических условиях. Описанные здесь методы являются простыми и недорогими in vitro </ Em> для оценки активности биосимиляров ритуксимаба. Таким образом, они могут быть полезны при биоподобном развитии, а также для контроля качества в биоподобном производстве. Кроме того, представленные методы могут быть экстраполированы на другие терапевтические mAb.
Introduction
Терапевтические антитела представляют собой рекомбинантные моноклональные антитела (mAb), разработанные для лечения различных патологий, включая рак, аутоиммунные и хронические заболевания, неврологические расстройства и другие. 1 . В настоящее время FDA одобрило более 40 терапевтических моноклональных антител, и ожидается, что в последующие годы ожидается их появление на рынке.
Ритуксимаб – это высокоаффинное химерное моноклональное антитело IgG1, одобренное для лечения лимфомы CD20 + В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL), CD20 + фолликулярной NHL, хронического лимфолейкоза и ревматоидного артрита 2 , 3 . Признание CD20, который сверхэкспрессируется в В-клетках ритуксимабом, индуцирует апоптоз; Активация комплемента; И антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) 3 . Патенты на этот препарат истекли в Европе и в США в 2013 и 2016 годахСоответственно. Таким образом, фармацевтические компании по всему миру разрабатывают ритуксимаб биоподобий. Как и в любом другом препарате для потребления человека, биоаналоги требуют одобрений регулирующих органов. Международные руководящие принципы показывают , что для МКИ, biosimilarity должна быть продемонстрированы путем сравнения физико – химические характеристики, фармакокинетика, эффективности и безопасности новых и эталонных продуктов 4.
Соответственно, методики, используемые в таких сравнениях должны оценить структурные и функциональные характеристики мАта, особенно с клинической значимостью. С этой целью, анализы в пробирке показывают несколько преимуществ по сравнению с экспериментами в естественных условиях (обзор в Chapman и др.) 5: I) в пробирке исследование более чувствительны к различиям между предлагаемым биоподобием и эталонным продуктом; б) в естественных условиях исследования должны быть выполнен в соответствующих видах, которые в течение многого мАта являютсянечеловеческие приматы; и III) , так как механизм действия, доклинической токсикологии, а также клинических эффектов эталонного продукта, хорошо известны, в естественных условиях исследования с биоподобий не могут обеспечить дополнительную полезную информацию. Соответственно, Руководство Европейского Союза по биоподобиям позволяет кандидатам ввести клинические испытания , основанные на надежном в одних только 6 лабораторных данных.
Здесь мы представляем два быстрых, экономические и простые анализы , которые оценивают биологическую активность ритуксимаба с использованием CD20 + культивируемых клеток. Эти анализы могут быть включены как часть сопоставимости упражнения для ритуксимаба биоподобных кандидатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Патентная истечение терапевтического МАБ способствует развитию биоподобий. Таким образом, существует потребность в простых методов, которые могут выявить различия в клинически значимых деятельности этих продуктов. CD20 + культивируемые клетки были использованы для оценки два кл…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
У авторов нет подтверждений.
Materials
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
References
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a Proposed Biosimilar RTXM83 and the Originator Rituximab. Bio Drugs. 30 (3), 225-231 (2016).
- Iwamoto, N., et al. Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nano-surface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. Biol Pharm Bull. 39 (7), 1187-1194 (2016).
- Chapman, K., et al. Waiving in vivo studies for monoclonal antibody biosimilar development: National and global challenges. MAbs. 8 (3), 427-435 (2016).
- Zembruski, N. C., et al. 7-Aminoactinomycin D for apoptosis staining in flow cytometry. Anal Biochem. 429 (1), 79-81 (2012).
- Salinas-Jazmin, N., Hisaki-Itaya, E., Velasco-Velazquez, M. A. A flow cytometry-based assay for the evaluation of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in cancer cells. Methods Mol Biol. 1165, 241-252 (2014).
- Teeling, J. L., et al. The Biological Activity of Human CD20 Monoclonal Antibodies Is Linked to Unique Epitopes on CD20. J Immunol. 177 (1), 362-371 (2006).
- Miranda-Hernandez, M. P., et al. Assessment of physicochemical properties of rituximab related to its immunomodulatory activity. J Immunol Res. 2015, 910763 (2015).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Ylera, F., et al. Off-rate screening for selection of high-affinity anti-drug antibodies. Anal Biochem. 441 (2), 208-213 (2013).
- Broyer, L., Goetsch, L., Broussas, M. Evaluation of complement-dependent cytotoxicity using ATP measurement and C1q/C4b binding. Methods Mol Biol. 988, 319-329 (2013).
- Herbst, R., et al. B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharm Exp Ther. 335 (1), 213-222 (2010).
- Lazar, G. A., et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (11), 4005-4010 (2006).
- Winiarska, M., et al. Statins impair antitumor effects of rituximab by inducing conformational changes of CD20. PLoS medicine. 5 (3), e64 (2008).
- Zhou, X., Hu, W., Qin, X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. Oncologist. 13 (9), 954-966 (2008).
- Hayashi, K., et al. Gemcitabine enhances rituximab-mediated complement-dependent cytotoxicity to B cell lymphoma by CD20 upregulation. Cancer Sci. 107 (5), 682-689 (2016).
- Mossner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Lapalombella, R., et al. A novel Raji-Burkitt’s lymphoma model for preclinical and mechanistic evaluation of CD52-targeted immunotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 14 (2), 569-578 (2008).
- Mitoma, H., et al. Mechanisms for cytotoxic effects of anti-tumor necrosis factor agents on transmembrane tumor necrosis factor alpha-expressing cells: comparison among infliximab, etanercept, and adalimumab. Arthritis Rheum. 58 (5), 1248-1257 (2008).
- Kaymakcalan, Z., et al. Comparisons of affinities, avidities, and complement activation of adalimumab, infliximab, and etanercept in binding to soluble and membrane tumor necrosis factor. Clin Immunol. 131 (2), 308-316 (2009).
- Zent, C. S., et al. Direct and complement dependent cytotoxicity in CLL cells from patients with high-risk early-intermediate stage chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with alemtuzumab and rituximab. Leuk Res. 32 (12), 1849-1856 (2008).
- Goswami, M. T., et al. Regulation of complement-dependent cytotoxicity by TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 35 (15), 1888-1898 (2016).
- Wang, A., et al. Induction of anti-EGFR immune response with mimotopes identified from a phage display peptide library by panitumumab. Oncotarget. , (2016).
- Ueda, N., et al. The cytotoxic effects of certolizumab pegol and golimumab mediated by transmembrane tumor necrosis factor alpha. Inflamm Bowel Dis. 19 (6), 1224-1231 (2013).
- Nesbitt, A., et al. Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel Dis. 13 (11), 1323-1332 (2007).
- Teeling, J. L., et al. Characterization of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas. Blood. 104 (6), 1793-1800 (2004).
