체외 방법에서 대상 바인딩 및 치료 항체 사이 CDC 유도 비교 : 응용 프로그램 생물학적 동등성 분석에

Summary

이 프로토콜은 표적 결합 및 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 유도와 같은 리툭시 맵의 두 가지 중요한 기능적 특성 에 대한 시험관 내 비교를 설명합니다. 상기 방법은 기준 리툭시 맵과 리툭시 맵 바이오시 밀러 사이의 일대일 비교를 위해 사용되었다. 이러한 분석법은 바이오시 밀러 개발이나 생산 과정에서의 품질 관리에 사용될 수 있습니다.

Abstract

치료 용 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)는 암을 포함한 여러 병리 상태의 치료에 적합하다. 제약 회사로 바이오시 밀러 단클론 항체의 개발은 시장 기회이지만, 또한 약물 접근성을 높이고 치료 관련 비용을 절감 할 수있는 전략이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 Daudi 세포에서 리툭시 맵과 목표 구속력 CDC 유도 평가를 설명한다. 이들 두 기능은 항체의 다른 영역의 구조를 필요 리툭시 맵에 의해 유도 된 임상 효과에 적합하다. 프로토콜은 기준 리툭시 맵의 좌우 비교 시판 리툭시 맵의 밀러를 허용한다. 평가 된 제품은 기본 물리 화학적 차이가 있음을 시사하고 임상에서 그 차이의 영향을 분석 할 필요성을 강조하는, 표적 결합 및 CDC 유도 모두에서 차이를 보였다. 여기에보고하는 방법은 체외에서 간단하고 저렴한 구성 </ EM> 리툭시 맵 바이오시 밀러의 활동의 평가를위한 모델. 따라서, 그들은 바이오시 밀러 개발시 유용뿐만 아니라, 바이오시 밀러 생산 품질 관리가 될 수 있습니다. 또한, 상기 제시된 방법은 다른 치료 용 모노클로 추정 될 수있다.

Introduction

치료 항체는 암,자가 면역 및 만성 질환, 신경 학적 장애 등 ¹ 등 다양한 병리의 치료를 위해 개발 된 재조합 단일 클론 항체 (단클론 항체)이다. 현재 FDA는 40 개 이상의 치료 단클론 항체에 대한 승인을 부여하고, 더는 다음 년 만에 시장에 도달 할 것으로 예상된다.

리툭시 맵은 CD20 ⁺ B 세포 비호 지킨 림프종 (NHL), CD20 ⁺ 여포 성 NHL, 만성 림프 구성 백혈병, 류마티스 관절염 ^{(2, 3)의} 치료를 위해 승인 된 높은 친 키메라 단일 클론 항체의 IgG1이다. 리툭시 맵에 의한 B 세포에서 과다 발현되는 CD20의 인식은 아폽토시스를 유도하고; 활성화를 보완; 항체 – 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) ^3. 이 약의 특허는 2013 년 2016 년 미국 유럽 및 만료각각. 따라서, 제약 회사는 전 세계적으로 리툭시 맵 바이오시 밀러를 개발하고있다. 인간의 소비에 대한 다른 약물과 마찬가지로, 바이오시 밀러는 규제 기관의 승인을 필요로합니다. 국제 가이드 라인은 단클론 항체에 대한 생물학적 동등성이 새로운 레퍼런스 제품 ^4의 물리 화학적 특성, 약물 동력학, 효능 및 안전성을 비교하여 증명되어야 함을 나타냅니다.

따라서, 이러한 비교에서 사용 된 방법은 모노클로 날 항체의 구조적 및 기능적 특성, 임상 적 관련성 특히 평가한다. 이를 위해, 시험 관내 분석법 (. 채프먼 등 검토) 생체 내 실험을 통해 여러 ^장점을 보여 ⁵ : ⅰ) 시험관 내 연구에서 제안 된 밀러 제품과 기준의 차이에 민감하다; ⅱ) 생체 내 연구에 많은 모노클위한 중요한 종으로 수행해야비 – 인간 영장류; 및 ⅲ) 작용 기전 임상전 독성, 참조 제품의 임상 효과 때문에 아니라 추가적인 유용한 정보를 제공하지 않을 수 밀러와 생체 내 연구에서, 공지되어있다. 따라서, 바이오시 밀러에 대한 유럽 연합 (EU)의 지침 후보 생체 데이터 만 ⁶ 강력한 기반으로 임상 시험을 입력 할 수 있습니다.

여기, 우리는 CD20 ⁺ 배양 세포를 사용 리툭시 맵의 생물학적 활성을 평가하는이 빠르고, 경제, 간단한 분석을 제시한다. 이 분석은 리툭시 맵 바이오시 밀러 후보에 대한 비교 동등성의 일부로 포함 할 수있다.

Protocol

1. 유동 세포 계측법에 의한 표적 결합의 평가 생물학적 물질 및 시약의 제조 10 % 열 불 활성화 태아 소 혈청 (H-IFBS)을 보충 한 RPMI 배양 배지 500 mL를 만든다. 문화 Daudi Burkitt의 림프종 (Daudi) 세포와 Daudi GFP + 세포 (RPMI와 75cm 2 배양 플라스크 사용). 5 % CO 2 가습 분위기에서 37 ° C에서 6 ~ 9 X 10 5 cells / mL가 될 때까지 배양한다. P…

Representative Results

전술 한 프로토콜을 사용하여, 결합 대상 및 기준 리툭시 맵의 CDC 유도 아시아에서 생산 밀러 리툭들 시판와 병렬로 비교 하였다. 의 Daudi 세포에서 모노클로 날 항체는 모두 농도 의존적으로 (도 1D)에 CD20을 결합. 결합 데이터의 비선형 회귀 분석 기준 및 밀러 리툭 각각 (도 1E)에 대해 0.978 및 0.848의 R …

Discussion

치료 단클론 항체의 특허 만료 바이오시 밀러의 개발을 추진하고 있습니다. 따라서, 이러한 제품의 임상 적 활동의 차이를 식별 할 수있는 간단한 방법이 필요하다. 목표 구속력 CDC 유도 : CD20 ⁺ 세포 배양은 리툭시 맵의 두 가지 주요 기능 특성의 평가를 위해 사용 하였다. 후자는 그것의 보수 ⁽⁹⁾ Fc 영역의 상호 작용에 주로 의존하면서 전자 활성은 항체의 Fab의 영역에 의…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.