En effektiv og fleksibel Cell Sammenlægning Metode til 3D Sfæroide Production

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Monolag cellekultur ikke tilstrækkeligt model in vivo adfærd af væv, der involverer komplekse celle-celle- og celle-matrix-interaktioner. Tre-dimensionelle (3D) cellekultur teknikker er en ny opfindelse udviklet til at tage manglerne ved klæbende cellekultur. Mens flere teknikker til generering væv analoger in vitro er blevet udviklet, er disse metoder ofte komplekse, dyre at etablere, kræver specialiseret udstyr, og er generelt begrænset af kompatibiliteten med kun visse celletyper. Her beskriver vi en hurtig og fleksibel protokol til aggregering celler i multicellulære 3D sfæroider af ensartet størrelse, der er kompatibel med væksten af ​​en række af tumorvæv og normalt cellelinier. Vi udnytter varierende koncentrationer af serum og methylcellulose (MC) at fremme forankringsuafhængig sfæroide generation og forhindre dannelsen af ​​cellemonolag i en meget reproducerbar måde. Optimale forhold for individual cellelinier kan opnås ved at justere MC eller serumkoncentrationer i klumpformet dannelse medium. 3D sfæroider genererede kan opsamles til brug i en lang række applikationer, herunder cellesignalering eller genekspression studier, kandidat lægemiddelscreening, eller i studiet af cellulære processer, såsom tumorcelleinvasion og migration. Protokollen er også let tilpasses til at generere klonale sfæroider fra enkelte celler, og kan tilpasses til at vurdere forankringsuafhængig vækst og anoikis-resistens. Samlet set vores protokol giver en let modificerbar fremgangsmåde til generering og anvendelse af 3D-celle sfæroider for at rekapitulere 3D mikromiljø af væv og modellere in vivo væksten af normale og tumorceller.

Introduction

Biologisk relevant vurdering af tumorcelle adfærd er udfordrende brug af traditionelle todimensionale (2D) cellekultur metoder, dels fordi disse ikke i tilstrækkelig grad afspejler celle mikromiljø fundet in vivo. Alternative fremgangsmåder inkorporerer ekstracellulære matrixkomponenter i kulturen (f.eks Boyden kammer assays) er mere fysiologisk repræsentant for in vivo vævsmiljø. Imidlertid kan de være begrænset til vurdering af den individuelle celle adfærd, og ikke rekapitulere komplekset in vivo kombinationer af celle-matrix og celle-celle-vekselvirkninger, der bidrager til væv eller tumorvækst ^{1, 2, 3.}

Anvendelsen af multicellulære sfæroider er en nyere fremgangsmåde, der mere præcist gengiver kompakt arkitektur in vivo cellevækst ^1,Fire. Sfæroider kan anvendes til at undersøge celle-matrix interaktioner af normale celler, men kan også fungere som tumor-analoger med model karakteristika tumorprogression, såsom metastatisk vækst eller medikamentresistens ^4.

Sfæroider kan dannes ved spredning af enkeltceller indlejret i en matrix ^5, eller hurtigere, ved at fremme aggregeringen af flere celler til dannelse af en enkelt celle klynge (f.eks hængende dråbe, centrifugering metoder) ^{6, 7.} Eksisterende celle aggregeringsteknikker kan kræve kostbare materialer eller specialiseret udstyr. Desuden har disse sfæroider har en bred vifte af størrelser og morfologier og kan være vanskelige at fremstille i store mængder, hvilket gør sammenligninger mellem vækstbetingelser eller behandlinger vanskelige. Endelig kan sfæroider genereres af disse metoder være vanskeligt at isolere fra det proteinholdige extracellastet, matrix, hvori de er indlejret til anvendelse i andre applikationer.

Her beskriver vi en robust og let modificerbar celleaggregering metode til hurtig dannelse af i samme størrelse celle sfæroider anvendelse af kommercielt tilgængelige U-bundede celle-afvisende plader og et inert adhæsionsfremmende matrix, methylcellulose. Når det er dannet, er disse multicellulære sfæroider let isoleres til anvendelse i en lang række applikationer. Protokollen er også nemt tilpasses til at generere sfæroider gennem celleproliferation, som kan anvendes til at vurdere andre celleprocesser. Her viser vi celleinvasion assays, kvantificeret ved immunfluorescensfarvning og en anoikis assay, som eksempel anvendelser af disse to forskellige klumpformet dannelse protokoller.

Protocol

BEMÆRK: Alle reagenser og hjælpematerialer er opført på listen Materials. 1. Sfæroide Produktion af Cell Aggregation Methylcelluloseopløsning: fremstilling af 100 ml af 100 mg / ml methylcellulose. Heat 50 ml ultrarent H2O til 80 ° C. Tilsæt 10 g methylcellulose pulver og omrør indtil partikler er jævnt fordelt. Bring til endelige volumen med koldt ultrarent H2O og omrør ved 4 ° C, indtil opløs…

Representative Results

Vi beskriver en fleksibel og effektiv metode til at generere diskrete sfæroider ved hjælp celle-afvisende plader og sfæroide dannelse medium suppleret med MC. Under de passende betingelser for MC og serum, individuelle celler sætte sig og klæber sammen ved midten af ​​brønden for at danne sfæroider med minimal vedhæftning til brøndens bund. Ved anvendelse af denne protokol blev sfæroider genereret fra en række forskellige cellelinjer (figur 2B). Titrering …

Discussion

Vi præsenterer en hurtig og fleksibel fremgangsmåde til fremstilling af 3D-celle sfæroider at modellere arkitekturen af in vivo væv anvendelse af billige og let tilgængelige reagenser. Vores protokol udnytter ikke-cytotoksiske og adhæsionsfremmende egenskaber MC ^{8, 9} at mediere celle aggregering og minimere cellemonolaget formation. I modsætning proteinbaserede matricer isoleret fra animalske kilder, MC er inert, ikke indeholder vækstfaktorer, o…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer