Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Monolaag celcultuur niet adequaat model van de in vivo gedrag van weefsels, die complexe cel-cel en cel-matrix interacties omvat. Driedimensionale (3D) celkweektechnieken een recente innovatie ontwikkeld om de tekortkomingen van hechtende celkweek pakken. Hoewel verschillende technieken voor het genereren van weefsel analogen in vitro ontwikkeld, deze werkwijzen zijn vaak complex, duur om, vereisen gespecialiseerde apparatuur en meestal beperkt door verenigbaarheid met slechts bepaalde celtypen. We beschrijven hier een snelle en flexibele protocol voor het aggregeren cellen tot multicellulaire sferoïden 3D consistente grootte die compatibel is met een groei van verschillende tumor en normale cellijnen. Wij gebruiken variërende concentraties serum en methylcellulose (MC) om verankering-onafhankelijke sferoïde generatie bevorderen en op zeer reproduceerbare wijze de vorming van celmonolagen. Optimale omstandigheden voor individual cellijnen kunnen worden verwezenlijkt door de MC of serumconcentraties in het bolvormige formatie medium. De 3D sferoïden gegenereerd kan worden verzameld voor gebruik in een breed scala van toepassingen, waaronder cell signaling of gene expression studies, testgeneesmiddel screening, of de studie van cellulaire processen zoals tumorcel invasie en migratie. Het protocol wordt ook direct aangepast om klonale sferoïden van enkelvoudige cellen genereren, en kan worden aangepast om verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand beoordelen. Overall, ons protocol bevat een gemakkelijk aanpasbaar werkwijze voor het genereren en gebruik 3D cellen sferoïden om de 3D micromilieu van weefsels recapituleren en het model van de in vivo groei van normale en tumorcellen.

Introduction

Biologisch relevante beoordeling van het gedrag van tumorcellen is een uitdaging met behulp van traditionele tweedimensionale (2D) celcultuur methoden, deels omdat deze niet voldoende afgestemd op het cel micro-omgeving gevonden in vivo. Alternatieve benaderingen waarin extracellulaire matrixcomponenten in de cultuur (bijvoorbeeld Boyden kamer assays) zijn fysiologisch representatief voor de in vivo weefselomgeving. Echter kunnen deze worden beperkt tot beoordeling van individuele gedrag van cellen en kan het complex in vivo combinaties van cel-matrix en cel-cel interacties die bijdragen aan weefsel of tumorgroei ^{1, 2, 3} niet herhalen.

Het gebruik van multicellulaire sferoïden is een recente aanpak die nauwkeuriger reproduceert de compacte architectuur van in vivo celgroei ^1,4. Sferoïden kunnen worden gebruikt om cel-matrix interacties van normale cellen te onderzoeken, maar kan ook als tumor analogen kenmerken van tumorprogressie, zoals metastatische groei of geneesmiddelresistentie ⁴ modelleren.

Sferoïden worden gevormd door de proliferatie van afzonderlijke cellen ingebed in een matrix ^5, of sneller, door het bevorderen van de aggregatie van meerdere cellen aan een cluster cellen (bv opknoping druppel, centrifugatiewerkwijzen) ^{6, 7} vormen. Bestaande cel aggregatie technieken kunnen kostbare materialen of gespecialiseerde apparatuur nodig. Bovendien hebben deze bolletjes hebben een breed scala aan afmetingen en morfologieën en kan moeilijk te produceren in grote hoeveelheden, het vergelijken van kweekomstandigheden of behandelingen moeilijk. Tenslotte kunnen sferoïden die door deze werkwijzen moeilijk te isoleren uit het eiwitmateriaal extracellaire matrix waarin ze zijn ingebed voor gebruik in andere toepassingen.

Hier beschrijven we een robuuste en gemakkelijk aanpasbaar celaggregatie methodologie voor de snelle vorming van gelijkvormige cellen sferoïden gebruikmaking van commercieel verkrijgbare U-bottom cell afstotend platen en een inert adhesiebevorderende matrix, methylcellulose. Eenmaal gevormd, worden deze multicellulaire sferoïden eenvoudig worden geïsoleerd voor gebruik in een breed scala van toepassingen. Het protocol is ook gemakkelijk aangepast sferoïden door middel van celproliferatie, die kunnen worden gebruikt om andere celprocessen beoordelen genereren. Hier tonen wij celinvasie assays gekwantificeerd door immunofluorescentie kleuring en een anoikis assay, zoals bijvoorbeeld toepassingen van deze twee sferoïde vorming protocollen.

Protocol

LET OP: Alle reagentia en hulpstoffen worden opgenomen in de Materials List. 1. Sferoïde productie door Cell Aggregation Methylcellulose oplossing: Bereid 100 ml 100 mg / ml methylcellulose. Warmte 50 ml ultrapuur H 2 O tot 80 ° C. Voeg 10 g methylcellulose poeder en schud totdat de deeltjes gelijkmatig worden verspreid. Breng eindvolume met koude ultrapuur H 2 O en roer bij 4 ° C totdat de oplossing hel…

Representative Results

We beschrijven een flexibele en efficiënte methode om discrete bolletjes met behulp van mobiele-afstotende platen en sferoïde vorming media waaraan MC genereren. Onder de geschikte omstandigheden MC en serum, individuele cellen regelen en klonteren in het midden van de put sferoïden met minimale hechting aan de putbodem vormen. Met dit protocol werden sferoïden gevormd uit verschillende cellijnen (figuur 2B). Titratie van MC serumconcentratie is vereist voor elke cel…

Discussion

We presenteren een snelle en flexibele werkwijze voor het vervaardigen van 3D cel sferoïden de architectuur van weefsels in vivo met behulp van goedkope en algemeen verkrijgbare reagentia modelleren. Ons protocol maakt gebruik van de niet-cytotoxische en adhesie-bevorderende eigenschappen van MC ^{8, 9} naar cel aggregatie bemiddelen en cel monolaag de vorming van een minimum te beperken. Unlike eiwit gebaseerde matrices geïsoleerd uit dierlijke bronnen,…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer