3 डी उपगोल उत्पादन के लिए एक कुशल और लचीला सेल एकत्रीकरण विधि
Summary
Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Abstract
Monolayer सेल संस्कृति पर्याप्त रूप से ऊतकों के vivo व्यवहार है, जो जटिल सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत शामिल है मॉडल नहीं है। तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति तकनीक हाल ही में एक पक्षपाती सेल संस्कृति की कमियों को संबोधित करने के लिए विकसित नवीनता है। इन विट्रो में ऊतक analogues पैदा करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, इन तरीकों में, अक्सर जटिल है, स्थापित करने के लिए महंगे हैं विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और आम तौर पर केवल कुछ प्रकार की कोशिकाओं के साथ संगतता के द्वारा सीमित हैं। यहाँ, हम लगातार आकार है कि ट्यूमर और सामान्य कोशिका लाइनों की एक किस्म के विकास के साथ संगत है की बहुकोशिकीय 3 डी spheroids में कोशिकाओं कुल के लिए एक तेजी से और लचीला प्रोटोकॉल का वर्णन। हम लंगर स्वतंत्र अंडाकार आकृति पीढ़ी को बढ़ावा देने और एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सेल monolayers के गठन को रोकने के लिए सीरम और मिथाइल सेलुलोज (एमसी) के अलग सांद्रता का उपयोग। व्यक्ति के लिए इष्टतम स्थितियोंidual सेल लाइनों अंडाकार आकृति गठन के माध्यम में एम सी या सीरम सांद्रता का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है। 3 डी उत्पन्न spheroids आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला, सेल संकेतन या जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन, उम्मीदवार दवा स्क्रीनिंग, या इस तरह के ट्यूमर सेल आक्रमण और पलायन के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन में शामिल है, में उपयोग के लिए एकत्र किया जा सकता है। प्रोटोकॉल भी आसानी से एकल कक्षों से प्रतिरूप spheroids उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित है, और लंगर स्वतंत्र विकास और anoikis-प्रतिरोध का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल पैदा करने और आदेश के ऊतकों के 3 डी microenvironment पुनरावृत्ति और सामान्य और ट्यूमर कोशिकाओं के vivo विकास मॉडल के लिए 3 डी सेल spheroids के उपयोग के लिए एक आसानी से परिवर्तनीय तरीका प्रदान करता है।
Introduction
ट्यूमर सेल व्यवहार के जैविक रूप से प्रासंगिक आकलन परंपरागत दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति तरीकों का उपयोग कर, भाग में, क्योंकि इन पर्याप्त रूप से सेल microenvironment विवो में पाया प्रतिबिंबित नहीं करते चुनौती दे रहा है। संस्कृति (जैसे, Boyden कक्ष assays) में बाह्य मैट्रिक्स घटकों को शामिल करने के लिए वैकल्पिक तरीकों में विवो ऊतक पर्यावरण के अधिक physiologically प्रतिनिधि हैं। हालांकि, वे अलग-अलग सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए सीमित किया जा सकता है, और सेल मैट्रिक्स और सेल सेल बातचीत है कि ऊतक या ट्यूमर के विकास को 1, 2, 3 में योगदान के विवो संयोजन में जटिल पुनरावृत्ति नहीं है।
बहुकोशिकीय spheroids के उपयोग, हाल ही में एक दृष्टिकोण है कि अधिक सही विवो सेल के विकास 1 की कॉम्पैक्ट वास्तुकला reproduces है4। Spheroids सामान्य कोशिकाओं की कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी इस तरह के मेटास्टेटिक विकास या दवा प्रतिरोध 4 के रूप में ट्यूमर प्रगति की विशेषताओं, मॉडल करने के लिए ट्यूमर analogues के रूप में कार्य कर सकते हैं।
Spheroids एक मैट्रिक्स 5, या अधिक तेजी में एम्बेडेड एकल कोशिकाओं के प्रसार द्वारा गठित किया जा सकता है, कई कोशिकाओं के एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के द्वारा एक एकल कोशिका क्लस्टर (जैसे, फांसी ड्रॉप, centrifugation तरीकों) 6, 7 के रूप में। मौजूदा सेल एकत्रीकरण तकनीक महंगा सामग्री या विशेष उपकरण की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, इन spheroids आकार और morphologies की एक विस्तृत श्रृंखला है और बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए, विकास की स्थिति या मुश्किल उपचार के बीच तुलना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। अंत में, इन तरीकों द्वारा उत्पन्न spheroids प्रोटीन extracel से अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता हैlular मैट्रिक्स जिसमें वे अन्य अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए एम्बेडेड रहे हैं।
यहाँ, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेट और एक निष्क्रिय आसंजन को बढ़ावा देने के मैट्रिक्स, मिथाइल सेलुलोज का उपयोग करते हुए लगातार आकार सेल spheroids का तेजी से गठन के लिए एक मजबूत और आसानी से परिवर्तनीय सेल एकत्रीकरण कार्यप्रणाली का वर्णन है। एक बार का गठन, इन बहुकोशिकीय spheroids आसानी से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग के लिए अलग कर रहे हैं। प्रोटोकॉल भी आसानी से सेल प्रसार, जो अन्य सेल प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के माध्यम से spheroids उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित है। यहाँ, हम सेल आक्रमण assays, immunofluorescence धुंधला द्वारा मात्रा, और एक anoikis परख, ये दो अलग अलग अंडाकार आकृति गठन प्रोटोकॉल का उदाहरण अनुप्रयोगों के रूप में दिखा।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम इन विवो ऊतकों सस्ती और व्यापक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करने की वास्तुकला मॉडल करने के लिए 3 डी सेल spheroids के उत्पादन के लिए एक तेजी से और लचीला तरीका मौजूद है। हमारी प्रोटोकॉल एम सी 8,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Materials
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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