En effektiv og fleksibel Cell Aggregation metode for 3D spheroid Produksjon

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Monolag cellekultur ikke tilstrekkelig modellere in vivo-oppførsel av vev, som involverer komplekse celle-celle og celle-matriks-interaksjoner. Tre-dimensjonale (3D) cellekulturteknikker er en ny oppfinnelse er utviklet for å løse manglene ved tilhenger cellekultur. Mens flere teknikker for å generere analoger vev in vitro er blitt utviklet, er disse metodene er ofte kompliserte, kostbare å etablere, krever spesialisert utstyr, og er generelt begrenset av kompatibilitet med bare visse celletyper. Her beskriver vi en rask og fleksibel protokoll for aggregering av celler inn i flercellede 3D sfæroider med ensartet størrelse som er kompatibel med vekst av en rekke tumor og normale cellelinjer. Vi bruker varierende konsentrasjoner av serum og metylcellulose (MC) for å fremme forankrings-uavhengig sfæroide generasjon og hindre dannelsen av cellemonolagene i en meget reproduserbar måte. Optimale forhold for individual cellelinjer kan oppnås ved å justere MC eller serumkonsentrasjoner i den sfæroide formasjonen medium. 3D-kuler som genereres kan samles for bruk i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert cellesignalisering eller genuttrykkstudier, legemiddelkandidat screening, eller i studiet av cellulære prosesser som tumorcelleinvasjon og migrering. Protokollen er også lett tilpasset for å generere klonale kuler fra enkeltceller, og kan være innrettet til å vurdere forankrings-uavhengig vekst og anoikis-motstand. Samlet gir vår protokoll et enkelt modifiser fremgangsmåte for å generere og bruke 3D-celleklumper for å rekapitulere 3D-mikromiljøet av vev og modellere in vivo vekst av normale og tumorceller.

Introduction

Biologisk relevant vurdering av tumorcelle oppførsel er utfordrende å bruke tradisjonelle to-dimensjonale (2D) cellekulturmetoder, blant annet fordi disse ikke gjenspeiler den cellemikro funnet in vivo. Alternative fremgangsmåter som omfatter ekstracellulære matrikskomponenter inn i kulturen (f.eks Boyden kammer analyser) er mer fysiologisk representative for in vivo vev miljø. De kan imidlertid være begrenset til vurdering av individuell celle oppførsel, og ikke rekapitulere komplekset in vivo kombinasjoner av celle-matrise- og celle-celle-interaksjoner som bidrar til vev eller tumorvekst ^{1, 2, 3.}

Bruken av flercellede sfæroider er en ny tilnærming som mer nøyaktig gjengir den kompakte arkitekturen av in vivo-cellevekst ^1,4. Sfæroidene kan brukes til å undersøke celle-matriks-interaksjoner av normale celler, men kan også fungere som tumor-analoger, for å modellere egenskapene til tumorprogresjon, slik som metastatisk vekst eller medikamentresistens ^4.

Sfæroider kan dannes ved spredning av enkeltceller innleiret i en matrise ^5, eller raskere, ved å fremme aggregeringen av flere celler til å danne en enkelt celle område (for eksempel hengende dråpe, sentrifugeringsmetoder) ^{6, 7.} Eksisterende celle aggregering teknikker kan kreve kostbare materialer eller spesialisert utstyr. I tillegg har disse kuler har et bredt spekter av størrelser og morfologi, og kan være vanskelig å fremstille i store mengder, noe som gjør sammenligninger mellom vekstbetingelser eller behandlinger vanskelig. Endelig kan sfæroidene som genereres av disse metodene være vanskelig å isolere fra det proteinholdige extracellular matriks hvori de er innleiret for bruk i andre anvendelser.

Her beskriver vi en robust og lett modifiserbar celle aggregering metode for rask dannelse av konsekvent dimensjonerte celleklumper ved hjelp av kommersielt tilgjengelige U-bunn celle-avstøtende plater og et inert klebeformidler matrise, metylcellulose. Straks de var dannet, er disse flercellede sfæroider isoleres lett for bruk i en lang rekke applikasjoner. Protokollen er også lett tilpasses for å generere kuler gjennom celleproliferasjon, som kan brukes til å vurdere andre celleprosesser. Her viser vi celle invasjon analyser, kvantifisert ved immunofluorescens-farging, og en anoikis assay, som beskrevet i Eksempel anvendelser av disse to forskjellige sfæroide formasjons protokoller.

Protocol

MERK: Alle reagenser og forbruksvarer er oppført i Materials List. 1. spheroid Produksjon av Cell Aggregation Metylcelluloseløsning: Fremstill 100 ml 100 mg / ml metylcellulose. Varme 50 ml ultrarent H2O til 80 ° C. Tilsett 10 g metylcellulose pulver og agitere til partiklene er jevnt dispergert. Bring til sluttvolum med kald ultrarent H2O og omrørt ved 4 ° C inntil løsningen blir klar, stråfarget, o…

Representative Results

Vi beskriver en fleksibel og effektiv metode for å generere diskrete kuler ved bruk av celle tette plater og sfæroide formasjons media supplert med MC. Under passende betingelser med hensyn MC og serum, individuelle celler seg og holder seg sammen i midten av brønnen for å danne kuler med minimal tilslutning til brønnbunnen. Ved hjelp av denne protokollen, ble sfæroider generert fra en rekke forskjellige cellelinjer (figur 2B). Titrering av MC og serumkonsentrasjon…

Discussion

Vi presenterer en rask og fleksibel metode for fremstilling av 3D-celle-kuler for å modellere den arkitekturen av in vivo vev ved bruk av rimelige og lett tilgjengelige reagenser. Vår protokoll utnytter ikke-cytotoksiske og heft fremmende egenskaper MC ^{8, 9 for} å megle celle aggregering og minimere cellemonolayer formasjonen. I motsetning til proteinbaserte matrikser isolert fra animalske kilder, er MC inert, ikke inneholder noen vekstfaktorer, og ka…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer