Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.
Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клеточного матрикса и межклеточных взаимодействий , которые способствуют росту ткани или опухоли 1, 2, 3.
Использование многоклеточных сфероидов является недавний подход , который более точно воспроизводит компактную архитектуру роста в естественных условиях клетки 1,4. Сфероидов может быть использован для исследования клетка-матрица взаимодействия нормальных клеток, но могут также выступать в качестве аналогов опухолевые для моделирования характеристик прогрессии опухоли, такие как рост метастазов или резистентности к лекарственным препаратам 4.
Сфероиды могут быть образованы путем пролиферации отдельных клеток , внедренных в матрицу 5, или более быстро, способствуя агрегации нескольких ячеек , чтобы сформировать один кластер клеток (например, висячей капли, методы центрифугирования) 6, 7. Существующие методы агрегации клеток может потребовать дорогостоящих материалов или специализированного оборудования. Кроме того, эти сфероиды имеют широкий диапазон размеров и морфологией и может быть трудно производить в больших количествах, что делает сравнения между условиями роста или лечения сложных. И, наконец, сфероиды, генерируемые этими способами может быть трудно отделить от белковый extracellular матрица, в которой они включены для использования в других приложениях.
Здесь мы описываем надежную и легко изменяемый методологии агрегации клеток для быстрого формирования последовательно размерных сфероидов клеток с использованием коммерчески доступного U-дно электролизера водоотталкивающий пластины и инертную адгезионный матрицу, метилцеллюлоза. После образования эти многоклеточные сфероиды легко выделены для использования в широком диапазоне применений. Протокол также легко адаптировать для создания сфероидов посредством пролиферации клеток, которые могут быть использованы для оценки других клеточных процессов. Здесь мы покажем вторжение клеток анализы, количественно с помощью иммунофлуоресценции окрашивания, а также анализ anoikis, в качестве примера применения этих двух различных протоколов формирования сфероида.
Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC 8, <sup…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Buffers | |||
10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Spheroid Formation | |||
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Invasion Assay | |||
Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
Name | Company | Catalog number | Comments |
For Immunofluorescence Microscopy | |||
#1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |