3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi
Summary
Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Abstract
Tek tabakalı hücre kültürü yeterli kompleks hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini içeren dokuların in vivo davranış, modelde mevcut değildir. Üç boyutlu (3D) hücre kültür teknikleri yapışık hücre kültürü eksikliklerin giderilmesi için geliştirilen yeni bir yeniliktir. In vitro doku analogları üretmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir birlikte, bu yöntemler, kurma pahalı sıklıkla karmaşık özel teçhizat gerektirebilir ve genellikle sadece belirli hücre tipleri ile uyumluluğu ile sınırlıdır. Burada, tümör ve normal hücre çizgileri, çeşitli büyüme ile uyumlu uygun boyutta çok-3D parçacıklarının içine hücreleri toplanmasını sağlayan bir hızlı ve esnek bir protokol açıklar. Bu ankrajdan bağımsız sferoid nesil teşvik etmek ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde, hücre mono tabakaları oluşumunu önlemek için, serum ve metil selüloz (MC) arasında değişen konsantrasyonlarda kullanmaktadır. Bireysel için en uygun koşullarınidual hücre çizgileri küremsi oluşturulması ortamda MC veya serum konsantrasyonlarını ayarlanması ile elde edilebilir. üretilen 3 boyutlu sferoidler hücre sinyal veya gen ekspresyon çalışmaları, bir aday ilaç tarama, veya tümör hücre istilası ve göç gibi hücresel süreçleri çalışma da dahil olmak üzere geniş bir uygulama aralığında, kullanım için toplanabilir. Protokol de kolayca tek hücre klonal sferoidler üretmek üzere uyarlanmış olan ve ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direncini değerlendirmek için adapte edilebilir. Genel olarak, iletişim kuralı üreten normal ve tümör hücrelerinin in vivo büyüme dokuların 3D mikro-özetlemek ve model-leştirilmesi için 3D hücresi parçacıklarının kullanılması için kolaylıkla değiştirilebilir bir yöntem sağlar.
Introduction
Tümör hücre davranışı biyolojik ilgili değerlendirme bu yeterli in vivo bulundu hücre mikro yansıtmaz, çünkü kısmen, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültür yöntemleri kullanılarak meydan okuyor. Kültür (ör Boyden Chamber tahlilleri) halinde hücre dışı matris bileşenleri içeren alternatif yaklaşımlar, in vivo doku ortamının daha fazla fizyolojik olarak temsilidir. Bununla birlikte, tek tek hücre davranışının değerlendirilmesi ile sınırlı olabilir ve doku ya da tümör büyümesi 1, 2, 3 katkıda hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri in vivo kombinasyonlarında karmaşık özetlemek yoktur.
Çok hücreli sferoidler kullanımı, daha doğru in vivo hücre büyümesi 1 kompakt mimarisini yeniden üreten bir son yaklaşımdır4. Sferoidler normal hücrelerin hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir, aynı zamanda bu tür metastatik büyüme ya da ilaç direnci 4 tümör progresyonu özelliklerini modeli tümör analogları olarak hareket edebilir.
Sferoidler bir matris 5 veya daha hızlı bir şekilde yerleştirilmiş tek hücre çoğalması ile oluşturulabilir, birden fazla hücre toplanmasını teşvik ederek, tek bir hücre kümesi (örneğin, asılı damla, santrifüj yöntemleri) 6, 7 oluşturulur. Mevcut hücre toplama teknikleri pahalı malzeme veya özel ekipman gerekebilir. Buna ek olarak, bu sferoidler boyutları ve morfolojileri geniş bir yelpazede ve büyüme koşulları ya da zor tedaviler arasındaki karşılaştırmalar, büyük miktarlarda üretilmesi için zor olabilir. Son olarak, bu yöntem tarafından üretilen sferoidler proteinli ekstrasellüler izole etmek zor olabilirlular matrisi içinde diğer uygulamalarda kullanılmak üzere yerleştirilmiştir.
Burada, ticari olarak temin edilebilen U tabanlı hücre itici plakalar ve bir atıl yapışkanlık arttırıcı matrisi, metil selüloz ile tutarlı bir şekilde boyutlandırılmış, hücre parçacıklarının hızlı oluşumu için sağlam ve kolayca değiştirilebilir hücresi agregasyonu yöntemler tarifedilmiştir. Oluştuktan sonra, bu çok hücreli küreler kolaylıkla geniş bir uygulama aralığında kullanım için izole edilir. Protokol de kolayca diğer hücre süreçleri değerlendirmek için kullanılabilir hücre çoğalması ile parçacıklarının üretilmesi için uyarlanmıştır. Burada, bu iki farklı küremsi oluşumu protokoller, örneğin uygulamaları immünofloresan boyama ile miktarı, hücre istilası deneyleri, bir anoikis deneyi göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ucuz ve yaygın olarak kullanılan reaktifler kullanılarak in vivo dokuların mimarisi model 3D hücre parçacıklarının üretilmesi için hızlı ve esnek bir yöntem mevcut. Bizim protokol MC 8, 9 sitotoksik olmayan yapışkanlık arttırıcı özellikleri hücre toplama aracılık etmek ve hücre tekli-tabakası oluşumunu en aza indirmek için patlatır. hayvansal kaynaklardan izole edilmiş protein bazlı matrisler farklı olarak, MC, inert …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Materials
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. . Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
