Her beskriver vi en hurtig ligevægtsdialyse (RED) -metode til måling af lægemiddelbindingen til kaseum fra lunge tuberkulose læsioner og hulrum. Protokollen anvendes også med en skummende makrofagafledt matrix, der er en effektiv surrogat til kaseum.
Udryddelsen af tuberkulose sygdom kræver lægemiddelregimer, som kan trænge igennem de mange lag af komplekse lungesygdomme. Narkotikafordeling i kaskaderne i hulrum og læsioner er særlig afgørende, fordi de har underpopulationer af stoftolerante bakterier, der også almindeligvis betegnes som persister. Eksisterende metoder til måling af lægemiddelindtrængning i tuberkuloselæsioner indebærer kostbare og tidskrævende farmakokinetiske in vivo undersøgelser koblet til bioanalytiske eller billeddannende teknikker. In vitro- måling af lægemiddelbindende til caseum-makromolekyler blev foreslået som et alternativ til sådanne teknikker, da denne binding forhindrer passiv diffusion af lægemolekyler gennem caseum. Hurtig ligevægtsdialyse er et hurtigt og pålideligt system til udførelse af plasmaprotein og vævsbindingsundersøgelser. I denne protokol anvendte vi en hurtig ligevægtsdialyse (RED) enhed til måling af lægemiddelbindende til homogenater af caseum, der er excisUd fra læsioner og hulrum af tuberkuloseinficerede kaniner. Protokollen beskriver også, hvordan man genererer en surrogatmatrix fra lipidbelastede THP-1-makrofager til anvendelse i stedet for caseum. Denne caseum / surrogatbindingsassay er et vigtigt redskab i tuberkulose-lægemiddelforskning og kan tilpasses til at hjælpe med at studere lægemiddelfordeling i læsioner eller abscesser forårsaget af andre sygdomme.
Behandlingen af lunger tuberkulose sygdom kræver effektiv distribution af lægemidler til forskellige typer læsioner. Nekrotiske læsioner og hulrum indeholder caseøse centre, der har subpopulationer af lægemiddeltolerante eller "vedholdende" bakterier. 1 , 2 Kavitis sygdommen er forbundet med dårligere helbredshastigheder og dårlig prognose. 3 , 4 Tidligere undersøgelser har vist ved hjælp af kvantitative og billeddannende teknikker, at evnen til at trænge ind i tilfældeum varierer betydeligt fra en lægemiddel klasse til en anden. 5 , 6 Disse metoder kræver imidlertid brug af dyreinfektionsmodeller, der er langsomme og kedelige. En in vitro- analyse, der måler lægemiddelbindende til ex vivo- caseum, blev designet. Denne binding viste sig at reversere korrelere med lægemiddelindtrængning i caseøse granulomer og er derforBruges som et prædiktivt værktøj. 7
Ligevægtsdialyse betragtes som guldstandardmetoden til plasmaproteinbindingsundersøgelser. Den hurtige ligevægtsdialyse (RED) -enhed giver et hurtigt, nemt at bruge og pålideligt system til udførelse af sådanne analyser. 8 Enheden består af to komponenter: engangsbrug, engangsindsatser bestående af 2 kamre adskilt af en lodret cylinder af semipermeabel membran; Og genanvendelige baseplader, der kan holde op til 48 indsatser ad gangen. Dialysemembranen har en 8 kDa molekylvægt cut-off (MWCO), der er ideel til lægemiddel-makromolekylbindende undersøgelser. Det høje overflade-til-volumenforhold i membranrummet tillader hurtig dialyse og ækvilibrering. Både indsatserne og basispladen er blevet valideret for minimal ikke-specifik binding. Kombinationen af den RØDE enhed med bioanalytiske teknikker giver nøjagtige estimater af de ubundne fraktioner af lægemidler i pLasma. 8 , 9
Selv om det oprindeligt var designet til at måle plasmaproteinbinding, er den RØDE enhed blevet anvendt i flere vævsbindende undersøgelser ved anvendelse af homogenater. 10 , 11 I denne protokol måler vi lægemiddelbindende til kaseum, de nekrotiske affald udskæres fra de nekrotiske læsioner og hulrum af tuberkuloseinficerede kaniner. Den akellulære og ikke-vaskulære karakter af kaseholdigt materiale gør det nemt at homogenisere til en homogen suspension, som er kompatibel med analysen.
Da dette caseum er kedeligt at producere og svært at komme forbi, har protokollen også været valideret til brug med en surrogatmatrix, der fremstilles fra skummede makrofager. THP-1 monocyt-afledte makrofager induceres med oliesyre for at akkumulere flere lipidlegemer, som giver dem deres "skumagtige" udseende. Disse lipidbelastede celler høstes ogForarbejdet til fremstilling af en matrix, som vi bruger som en surrogat til caseum. Denne undersøgelse har vist, at lægemiddelbindende til denne surrogatmatrix korrelerer godt med binding til caseum, hvilket effektivt efterligner in vivo- processen, der forhindrer lægemiddelindtrængning i caseous-kernen i granulomer og hulrum.
Pulmonale nekrotiske læsioner og hulrum hos tuberkuloseinficerede patienter indeholder subpopulationer af bakterier, der er modstridende over for lægemiddelbehandling. Caseous kernerne i disse strukturer er særligt ansvarlige for at opbevare disse persister i et ekstracellulært miljø. 16 Gunstig fordeling af antibakterielle midler til disse fjerntliggende steder antages at være en vigtig determinant for tuberkulosemedicinske virkninger. Før valideringen af denne protokol var der inge…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker at takke Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X og Trius Therapeutics for at give bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid og tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li og Danielle Weiner gav støtte med MALDI-analyse, bioanalytiske metoder, forberedelse af caseum-surrogatet, kemisk syntese og isolering af kanin caseum. Dette arbejde blev udført med finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 og OPP1024050 til V. Dartois, NIH Fælles Instrumentation Grant S10OD018072, samt fælles finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation og Wellcome Trust for A Center of Excellence For blyoptimering for sygdomme i udviklingslandene til P. Wyatt.
New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |