Ein<em> In Vitro</em> Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt
Summary
Hier beschreiben wir eine schnelle Gleichgewichtsdialyse (RED) Methode zur Messung der Arzneimittelbindung an den Fall aus pulmonalen Tuberkuloseläsionen und Hohlräumen. Das Protokoll wird auch mit einer schaumigen Makrophagen-abgeleiteten Matrix verwendet, die ein wirksames Surrogat zum Fall ist.
Abstract
Die Tilgung der Tuberkulose-Krankheit erfordert Medikamentenregimen, die die Mehrfachschichten komplexer Lungenläsionen durchdringen können. Die Arzneimittelverteilung in den käsigen Adern von Hohlräumen und Läsionen ist besonders wichtig, weil sie Subpopulationen von drogenverträglichen Bakterien, die auch allgemein als persisten bezeichnet werden, beherbergen. Bestehende Methoden zur Messung der Arzneimittelpenetration bei Tuberkulose-Läsionen beinhalten kostspielige und zeitaufwändige in vivo- pharmakokinetische Studien, gekoppelt an bioanalytische oder bildgebende Verfahren. Die In-vitro- Messung der Arzneimittelbindung an Fallmakromoleküle wurde als Alternative zu solchen Techniken vorgeschlagen, da diese Bindung die passive Diffusion von Arzneimittelmolekülen durch den Fall beeinträchtigt. Die schnelle Gleichgewichtsdialyse ist ein schnelles und zuverlässiges System zur Durchführung von Plasmaprotein- und Gewebebindungsstudien. In diesem Protokoll haben wir eine schnelle Gleichgewichts-Dialyse (RED) -Gerät verwendet, um die Arzneimittelbindung an Homogenate von caseum zu untersuchen, das excis istAus den Läsionen und Hohlräumen von Tuberkulose-infizierten Kaninchen. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Surrogatmatrix aus lipidbeladenen THP-1-Makrophagen erzeugt, um anstelle von caseum zu verwenden. Dieser Fall / Surrogat-Bindungstest ist ein wichtiges Instrument in der Tuberkulose-Wirkstoffforschung und kann angepasst werden, um die Arzneimittelverteilung bei Läsionen oder Abszessen, die durch andere Krankheiten verursacht werden, zu untersuchen.
Introduction
Die Behandlung der pulmonalen Tuberkulose-Krankheit erfordert eine effektive Verteilung der Medikamente in verschiedene Arten von Läsionen. Nekrotische Läsionen und Hohlräume enthalten käsige Zentren, die Subpopulationen von drogenverträglichen oder "persistenten" Bakterien beherbergen. 1 , 2 Die Kavitationserkrankung ist mit minderwertigen Heilungsraten und schlechter Prognose verbunden. 3 , 4 Frühere Studien haben gezeigt, dass mit Hilfe von quantitativen und bildgebenden Techniken die Fähigkeit, in den Fall zu dringen, signifikant von einer Medikamentenklasse zur anderen variiert. 5 , 6 Diese Methoden erfordern jedoch die Verwendung von Tierinfektionsmodellen, die langsam und langwierig sind. Ein in vitro- Assay, der die Arzneimittelbindung an ex vivo caseum misst, wurde entworfen. Diese Bindung wurde gefunden, um umgekehrt mit der Arzneimittelpenetration in käsigen Granulomen zu korrelieren und ist daherAls prädiktives Werkzeug verwendet. 7
Gleichgewichtsdialyse gilt als der Goldstandardansatz für Plasmaprotein-Bindungsstudien. Die RED-Vorrichtung (Rapid Equilibrium Dialyse) bietet ein schnelles, einfach zu bedienendes und zuverlässiges System zur Durchführung solcher Assays. 8 Das Gerät besteht aus zwei Komponenten: Einweg-Einweg-Einsätze bestehend aus 2 Kammern, die durch einen vertikalen Zylinder mit halbdurchlässiger Membran getrennt sind; Und wiederverwendbare Basisplatten, die bis zu 48 Einsätze zu einem Zeitpunkt aufnehmen können. Die Dialysemembran hat einen 8 kDa-Molekulargewichts-Cutoff (MWCO), der sich ideal für Arzneimittel-Makromolekül-Bindungsstudien eignet. Das hohe Flächen-zu-Volumen-Verhältnis des Membranabteils ermöglicht eine schnelle Dialyse und Äquilibrierung. Sowohl die Einsätze als auch die Basisplatte wurden für eine minimale unspezifische Bindung validiert. Die Kombination der RED-Vorrichtung mit bioanalytischen Techniken liefert genaue Schätzungen der ungebundenen Fraktionen von Arzneimitteln in pLASMA. 8, 9
Obwohl ursprünglich Plasmaproteinbindung zu messen, das RED-Gerät wird in mehreren Gewebebindungsstudien verwendet worden, unter Verwendung von Homogenaten. 10, 11 in diesem Protokoll messen wir Medikament caseum Bindung, die nekrotische Ablagerungen von den nekrotischen Läsionen und der Hohlräume tuberculosis infizierten Kaninchen ausgeschnitten. Die azelluläre und nicht-vaskuläre Natur des käsigen Materials macht es leicht in eine homogene Suspension zu homogenisieren, die mit dem Assay kompatibel ist.
Da caseum ist mühsam herzustellen und schwer zu bekommen, wird das Protokoll auch für die Verwendung mit einer Surrogat-Matrix validiert, die von schaumigen Makrophagen hergestellt wird. THP-1 Monozyten abgeleiteten Makrophagen werden mit Ölsäure induziert, um mehrere Lipidkörper ansammeln, die sie geben ihre ‚schäumenden‘ Aussehen. Diese Lipid-beladenen Zellen werden geerntet undverarbeitet, um eine Matrix zu erzeugen, die wir als Ersatz verwenden, um caseum. Diese Studie hat gezeigt , dass die Drogen Bindung an diese Surrogat Matrix korreliert gut mit zu caseum Bindung, effektiv den in vivo nachahmt Prozess, die Arzneimittelpenetration in dem käsigen Kern von Granulomen und Hohlräumen verhindert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pulmonary nekrotische Läsionen und Hohlräumen bei Tuberkulose-infizierten Patienten enthalten Subpopulationen von Bakterien, die zur medikamentösen Behandlung recalcitrant sind. Die käsigen Kerne dieser Strukturen sind besonders verantwortlich, diese persisters in einer extrazellulären Umgebung für die Beherbergung. 16 günstige Verteilung von antibakteriellen Mitteln in diese entfernten Standorte wird angenommen , dass eine wichtige Determinante der Tuberkulose Wirksamkeit von Medikamenten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wünschen Johnson & Johnson, der TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X und Trius Therapeutics danken für die Bereitstellung von Bedaquilin, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid und Tedizolid sind. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li und Danielle Weiner unterstützte mit MALDI-Analyse, bioanalytische Verfahren, Herstellung der caseum Surrogat, chemische Synthese und Isolierung von Kaninchen-caseum. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Bill und Melinda Gates-Stiftung, Auszeichnung # OPP1044966 und OPP1024050 V. Dartois, NIH Geteilt Instrumentation Grant-S10OD018072 sowie eine gemeinsame Finanzierung von der Bill and Melinda Gates Foundation und Wellcome Trust für ein Kompetenzzentrum durchgeführt für Lead-Optimierung für Krankheiten der Dritten Welt zu P. Wyatt.
Materials
| New Zealand White Rabbits | Covance | – | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145x20mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
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