रेडियो-लेबल वाली जीटीपी बाइंडिंग के माध्यम से जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग को मापना
Summary
ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) बाध्यकारी जी-प्रोटीन-युग्मित रीसेप्टर (जीपीसीआर) सक्रियण में प्रारंभिक घटनाओं में से एक है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित है कि फ़ार्माकोलॉजिकल तरीके से रेडियो-लेबल वाले जीटीपी एनालॉग, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) ट्राइफोस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) के बंधन की निगरानी के द्वारा विशिष्ट जीपीसीआर-लैगंड इंटरैक्शन को चिह्नित किया जाता है। रुचि के लिगेंड की प्रतिक्रिया
Abstract
जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स ( जीपीसीआर ) ट्रांस्मेमेब्रन रिसेप्टर्स के एक बड़े परिवार हैं जो सामान्य सेलुलर फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और एनलसेसिआ, ब्लड प्रेशर विनियमन और मानसिक रोग के उपचार सहित कई संकेतों के लिए एक प्रमुख औषधीय लक्ष्य का गठन करते हैं। लिगंड बंधन पर, जीपीसीआर ने ग्नोसाइन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) के निगमन को उत्तेजित करके इंट्रासेल्यूलर जी-प्रोटीन्स के सक्रियण को उत्प्रेरित किया। सक्रिय जी प्रोटीन तब संकेतक मार्ग को उत्तेजित करता है जो सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हैं। जीपीआरआर सिग्नलिंग को जीटीपी के एक रेडियोलैबैड और गैर-हाइड्रोलाइजनीय फॉर्म को शामिल करके, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) त्रिफॉस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) को जी-प्रोटीन में मिलाकर मापा जा सकता है। अन्य तरीकों के विपरीत जो अधिक डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रक्रियाओं का आकलन करते हैं, [ 35 एस] जीपीसीएस बाध्यकारी उपाय जीपीसीआर सिग्नलिंग में एक समीपस्थ घटना को मापते हैं और महत्वपूर्ण रूप से, एगोनिस को भेद कर सकते हैंटीएस, विरोधी, और व्युत्क्रम एगोनिस्ट वर्तमान प्रोटोकॉल जीपीसीआर सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट पद्धति की रूपरेखा तैयार करता है, जो कि एक आरपीटीपीआरपीसीआर, μ-opioid रिसेप्टर (एमओआर 1) के क्रूड झिल्ली की तैयारी का उपयोग कर रहा है। हालांकि कोशिकाओं और ऊतकों को भिन्न करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूद हैं, कई लागत-निषेधात्मक, थकाऊ, और / या गैर-मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। वर्तमान पद्धति एक साधारण प्रक्रिया प्रदान करती है जो कार्यात्मक क्रूड झिल्ली को समृद्ध करती है। एमओआर 1 को अलग करने के बाद, इसके एगोनिस्ट के विभिन्न औषधीय गुणों [डी-एला, एन-मेफे, ग्लाय-ओल] -एकेफेलिन (डैम्गो) और विरोधी, नलोक्सोन, निर्धारित किए गए थे।
Introduction
जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) एनाल्जेसिया, ऑल्फ़ाइज और वर्तन 1 सहित शारीरिक प्रक्रियाओं की उल्लेखनीय सरणी के लिए जिम्मेदार कोशिका-सतह रिसेप्टर्स के एक बड़े परिवार हैं। जीपीसीआर विशिष्ट बाहरी संकेतों को संवेदन करते हुए कार्य करते हैं और बाद में इंटरासेल्युलर सिगनल को उत्तेजित करते हैं। इसलिए वे एक सेल के बाहरी और आंतरिक वातावरण के बीच एक महत्वपूर्ण जंक्शन को चिह्नित करते हैं। जीपीसीआर जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए वे दोनों बुनियादी शोध और दवा की खोज 2 , 3 के लिए प्रमुख लक्ष्य बन गए हैं।
असंतोषपूर्ण ligands बाध्य अन्य रिसेप्टर परिवारों के विपरीत, GPCR बहुत अलग प्रकार के अणुओं बाध्य कर सकते हैं। जबकि एक जीपीसीआर पेप्टाइड्स के साथ बातचीत कर सकता है, एक अन्य फोटॉन, छोटे अणुओं, या आयन 1 , 4 को समझ सकता है। जबकि उनके ligands विविध हैं, GPCR अपने समग्र वास्तुकार में एकीकृत कर रहे हैंUre और फ़ंक्शन व्यक्तिगत जीपीसीआर बाहरी एल्यूमीनियम टर्मिनलों और इंट्रासेल्युलर कार्बोक्ज़िल टर्मिनल 5 , 6 के साथ सात α-पेचिक ट्रान्समीटरब्रेन प्रोटीन से बना है। जीसीपीसीआर को इंट्रासेल्युल्युलर जी-प्रोटीन से जोड़ा जाता है- हेरोटेरमरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स, जो कि α, β और γ सबुनेट्स से बने होते हैं-जो विविध सिग्नलिंग पाथवे 7 की मध्यस्थता करते हैं। जी α सबुनेट एक ग्वानिन न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग प्रोटीन है, जो कि जब गुआनोसिन डीफोसफेट (जीडीपी) से जुड़ा हुआ है और सक्रिय होता है, तब वह गनोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) 8 , 9 के लिए बाध्य होता है। जब जीपीसीआर उनके लिंगों को बाँधते हैं, तो वे एक गठनात्मक परिवर्तन से गुजरते हैं जो जी βγ से अलग होने के लिए जी α को अनुमति देता है, जिससे जी-डीटी 7 के लिए जीडीपी का आदान-प्रदान करने की अनुमति देता है। रिसेप्टर ही अपने कार्बोक्जिल टर्मिनल पर विभिन्न सरीन / थ्रेऑन द्वारा फॉस्फोरिलेटेड है10 , 11 के अंतराल में और रिसेप्टर सिग्नल को एएनएन्यूएट करने के लिए आंतरिक , 12 , 13 , 14 । इस बीच, सक्रिय जी α मोनोमर और जी βγ डिमर विशिष्ट संकेत मार्गों को सक्रिय करने के लिए आगे बढ़ते हैं 7 । प्रत्येक जी प्रोटीन सबयूनेट के कई आइसफॉर्म हैं, और प्रत्येक आइसफोर्म विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम पथ और द्वितीयक दूत सिस्टम को लक्षित करता है। प्रमुख जी α इफॉर्मस में जी एस , जी क्यू , जी आई / ओ और जी 12-13 शामिल हैं । आमतौर पर, व्यक्तिगत जीपीसीआर एक विशिष्ट जी α आइफोरम के साथ संबद्ध होते हैं, जिससे एक विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया 1 के लिए बाहरी उत्तेजना जोड़ता है।
जीपीसीआर-लैगंड इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए रिसेप्टर की जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है। जीडीपी / जीटीपी विनिमय जल्द से जल्द पूर्व संध्या में से एक हैएनटीएस जो लिगंड बाइंडिंग का अनुसरण करता है, जीटीपी बाध्यकारी निगरानी जीपीसीआर सक्रियण या अवरोध को माप सकता है। जीपीसीआर सिग्नलिंग में अधिक डाउनस्ट्रीम की घटनाओं का आकलन अक्सर मात्रात्मक या स्टोइकीओमेट्रिक के रूप में नहीं होता है, जो आंशिक लोगों से पूर्ण एगोनिस्टों को अलग नहीं कर सकते हैं, और महंगी अभिकर्मकों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, जीटीपी प्रोटीन के लिए जीटीपी बढ़ाकर जीपीसीआर सक्रियण के बाद एक लगभग सार्वभौमिक घटना है, जिसका अर्थ है कि जीपीसी बंधन को मापने के लिए अधिकांश जीपीसीआर की गतिविधि की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से लागू परख है। GTP बाइंडिंग को मापना एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण है जो जीपीसीआर संकेतों को ब्याज के रिसेप्टर या देशी ऊतक में अत्यधिक से छूने वाले कोशिकाओं में निगरानी करता है। जीपीसीआर सिग्नलिंग पर एगोनिस्ट और एंटीजनिस्ट की गतिविधि का मात्रात्मक निर्धारण करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक आरम्भिक जीपीसीआर, μ-opioid रिसेप्टर (एमओआर 1) के प्रयोग से कार्यात्मक जीटीपी बाध्यकारी परख का विवरण देता है।
यह प्रोटोकॉल पहले बताता है कि कैसे मरो 1 से अधिक कोशिकाओं से कच्चे झिल्ली को अलग करने के लिए। ध्यान दें थायह प्रोटोकॉल ओवरेक्सेशन सिस्टम तक ही सीमित नहीं है और झिल्ली के कई स्रोतों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें मूल ऊतक या तैयारी कई रिसेप्टर्स और जी प्रोटीन 15 व्यक्त करते हैं। प्रोटोकॉल तो विवरण देता है कि [डी-एला, एन-मेफे, गली-ओल] -एकेफेलिन (डैम्गो) या नलोॉक्सोन, एक एमओआर 1 एगोनिस्ट और विरोधी, की अलग-अलग सांद्रता के जवाब में इन झिल्ली को रेडियोधर्मी GTP एनालॉग के बंधन को मापने का तरीका बताया गया है, क्रमशः। जीटीपी एनालॉग, [ 35 एस] गैनोसिन -5'-ओ- (3-थियो) ट्राइफॉस्फेट ([ 35 एस] जीटीपीसीएस) गैर-हाइड्रोलाइजबल है। यह प्रॉपर्टी महत्वपूर्ण है क्योंकि जी α सब्यूनिट्स आंतरिक जीटीपेज गतिविधि 7 प्रदर्शित करती है और हाइड्रोलाइज़ेबल जीटीपी रेडियोोकैमिकल पर लेबल वाले गामा फॉस्फेट को समाप्त कर देगा। झिल्ली तब गिलास फाइबर फिल्टर पर फंसे जाते हैं और धोया जाता है, जिसके बाद रेडियोलैबैलेटेड जीटीपी तरल जगमगाहट की गिनती द्वारा निर्धारित किया जाता है। कई औषधीय मानकों को कैरेक्टर में लिया जा सकता हैएगोनिस्टों के लिए आधे-अधिकतम प्रतिक्रिया (ईसी 50 ) और हिल गुणांक (एन एच ) और आधे से अधिक अवरोधक एकाग्रता (आईसी 50 ) और विरोधी के लिए संतुलन विस्थापन निरंतर (के बी ) सहित रिसेप्टर-लैगंड इंटरैक्शन 16 , 17 , 18
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल दो अलग-अलग लेकिन पूरक तरीकों का वर्णन करता है: अलग-अलग कोशिकाओं और ऊतकों को व्यापक लेकिन अलग डिब्बों में विभाजित करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण और [ 35 एस] GTPγS बाइंडिंग को मापकर जीपीसीआ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान डीए-000266 और मेडिकल वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम टी 32 अनुदान (सीवी, एनडब्ल्यूजेड, और पीसीएस) द्वारा समर्थित था। लेखकों को लाइब्रेरी ऑफ साइंस और मेडिकल चित्रण के लिए सोमर्स 18: 24 (सोमर्सॉल्ट 1824 डॉट कॉम) भी स्वीकार करना चाहेंगे।
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
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