Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio
Summary
Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.
Abstract
I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori transmembranti che svolgono un ruolo critico nella normale fisiologia cellulare e costituiscono un importante obiettivo farmacologico per molteplici indicazioni, tra cui l'analgesia, la regolazione della pressione arteriosa e il trattamento delle malattie psichiatriche. Su legame vincolante, i GPCR catalizzano l'attivazione delle proteine G intracellulari, stimolando l'incorporazione di guanosina trifosfato (GTP). Le proteine G attivate stimolano quindi i percorsi di segnalazione che provocano risposte cellulari. La segnalazione di GPCR può essere monitorata misurando la incorporazione di GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([ 35 S] GTPγS) in proteine G, di una forma radiolabelata e non idrolizzabile. A differenza di altri metodi che valutano più processi di segnalazione a valle, il binding di [ 35 S] GTPγS misura un evento prossimale nel segnale GPCR e, cosa importante, può distinguere l'agonisTs, antagonisti e agonisti inversi. Il presente protocollo descrive un metodo sensibile e specifico per studiare la segnalazione GPCR utilizzando preparazioni a membrana grezze di un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1). Anche se esistono approcci alternativi a frazionamento di cellule e tessuti, molti sono cost-prohibitive, noiosi e / o richiedono apparecchiature di laboratorio non standard. Il metodo presente fornisce una procedura semplice che arricchisce le membrane grezze funzionali. Dopo l'isolamento di MOR1, sono state determinate varie proprietà farmacologiche del suo agonista, [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkephalin (DAMGO) e antagonista, naloxone.
Introduction
I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori della superficie cellulare responsabile di una notevole serie di processi fisiologici, tra cui analgesia, olfazione e comportamento 1 . I GPCR agiscono rilevando segnali esterni specifici e successivamente stimolando la segnalazione intracellulare. Esse pertanto rappresentano una giunzione chiave tra gli ambienti esterni e interni di una cella. A causa del ruolo critico che i GPCR svolgono in biologia, sono diventati obiettivi principali sia per la ricerca di base che per la scoperta di droga 2 , 3 .
A differenza di altre famiglie di recettori che legano ligandi discreti, i GPCRs possono legare tipi molto diversi di molecole. Mentre un GPCR può interagire con i peptidi, un altro può sentire i fotoni, le piccole molecole oi ioni 1 , 4 . Mentre i loro ligandi sono diversi, GPCRs sono unificati nel loro architetto globaleUre e funzione. I GPCR individuali sono costituiti da sette proteine transmembrana a-elicoidali con terminali amino terminali extracellulari e terminali carbossilici intracellulari 5 , 6 . I GPCR sono accoppiati a complessi proteici intracellulari di proteine G-eterotrimerici composti da subunità α, β e γ, che mediano diversi percorsi di segnalazione 7 . La subunità G α è una proteina legante nucleotidica guanina che è inattiva quando legata al guanosina difosfato (PIL) e attiva quando legata al guanosina trifosfato (GTP) 8 , 9 . Quando i GPCR legano i loro ligandi, subiscono una modifica conformazionale che consente di dissociare G α da G βγ , consentendo così G α di scambiare il PIL per GTP 7 . Il recettore stesso è fosforilato al suo terminale carbossilico da varie serine / treoneIne chinasi 10 , 11 e internalizzate per attenuare la segnalazione dei recettori 12 , 13 , 14 . Nel frattempo, il monomero G α attivato e il dimettore G βγ procedono ad attivare percorsi di segnalazione distinti 7 . Esistono diverse isoforme di ciascuna subunità di proteina G, e ogni isoforma si rivolge a particolari vie a valle e sistemi secondari di messaggistica. Le principali isoforme G α includono G s , G q , G i / o e G 12-13 . In genere, i GPCR individuali associano una particolare isoforma G α , collegando così uno stimolo esterno ad una risposta cellulare specifica 1 .
Caratterizzare un'interazione GPCR-ligand è fondamentale per comprendere la biologia del recettore. Poiché lo scambio di PIL / GTP è una delle prime vigilanzeNts che segue il binding ligand, monitoraggio del legame GTP può misurare l'attivazione o l'inibizione del GPCR. Analizzare più eventi a valle nella segnalazione GPCR non è spesso quantitativa o stoichiometrica, non può distinguere i full agonisti da quelli parziali e può richiedere costosi reagenti. Inoltre, un aumento del legame GTP alle proteine G α è un evento quasi universale dopo l'attivazione di GPCR, il che significa che la misurazione del legame GTP è un saggio generalmente applicabile per monitorare l'attività della maggior parte dei GPCRs. La misurazione del legame GTP è un approccio semplice e rapido per monitorare la segnalazione GPCR nelle cellule che esprimono l'espressione del recettore di interesse o nel tessuto nativo. Il presente protocollo specifica un test funzionale di legame GTP utilizzando un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1), per determinare quantitativamente l'attività di un agonista e antagonista sulla segnalazione GPCR.
Questo protocollo indica innanzitutto come isolare le membrane grezze dalle cellule che sovrasta l'espressione MOR1. Nota thaQuesto protocollo non è limitato ai sistemi di sovraespressione e può essere applicato a molte fonti di membrana, compresi i tessuti nativi oi preparati che esprimono più recettori e proteine G. Il protocollo spiega poi come misurare il legame di un analogo GTP radioattivo a queste membrane in risposta a varie concentrazioni di [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkefalin (DAMGO) o naloxone, agonista e antagonista MOR1, rispettivamente. L'analogo GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) non è idrolizzabile. Questa proprietà è critica perché le subunità G α presentano un'attività intrinseca di GTPase 7 e eliminerebbero il gamma fosfato etichettato su una radiochimica GTP idrolizzabile. Le membrane vengono quindi intrappolate sui filtri in fibra di vetro e lavati, dopo di che il GTP radiomarcato viene quantificato mediante conteggio a scintilla liquida. Molti parametri farmacologici possono essere derivati per caratterizzareL'interazione del recettore-ligando, compresa la risposta half-maximal (EC 50 ) e il coefficiente Hill (n H ) per gli agonisti e la concentrazione inibitore half-maximal (IC50) e la costante di dissociazione di equilibrio (Kb) per gli antagonisti 16,17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive due metodi separati ma complementari: un approccio semplice per frazionare cellule e tessuti in compartimenti larghi ma distinti e un mezzo per indagare la segnalazione di GPCR misurando il legame di [ 35 S] GTPγS.
La frazionamento cellulare efficace ha una vasta gamma di applicazioni, che vanno dall'estrazione e dall'arricchimento delle proteine, alla valutazione della localizzazione subcellulare delle proteine, allo studio della farmacolo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da National Institutes of Health grant DA-000266 e dal programma di addestramento del medico scientifico T32 (CV, NWZ e PCS). Gli autori vorrebbero anche riconoscere somersault18: 24 (somersault1824.com) per la Biblioteca di Scienza e Illustrazioni Mediche.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
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