Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio
Summary
La unión a trifosfato de guanosina (GTP) es uno de los primeros eventos en la activación de receptores acoplados a proteína G (GPCR). Este protocolo describe cómo caracterizar farmacológicamente las interacciones específicas de GPCR-ligando mediante la monitorización de la unión del análogo de GTP marcado con radio, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en Respuesta a un ligando de interés.
Abstract
Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores transmembrana que desempeñan papeles críticos en la fisiología celular normal y constituyen un objetivo farmacológico principal para múltiples indicaciones, incluyendo la analgesia, la regulación de la presión arterial y el tratamiento de la enfermedad psiquiátrica. Tras la unión del ligando, los GPCR catalizan la activación de las proteínas G intracelulares estimulando la incorporación de guanosina trifosfato (GTP). Las proteínas G activadas estimulan entonces las vías de señalización que provocan respuestas celulares. La señalización de GPCR puede monitorizarse midiendo la incorporación de una forma radiomarcada y no hidrolizable de GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), en proteínas G. A diferencia de otros métodos que evalúan más procesos de señalización aguas abajo, la unión de [35S] GTPγS mide un evento proximal en la señalización de GPCR y, de manera importante, puede distinguir agonisSt, antagonistas y agonistas inversos. El presente protocolo describe un método sensible y específico para estudiar la señalización de GPCR usando preparaciones de membrana cruda de un GPCR arquetípico, el receptor de opioides μ (MOR1). Aunque existen enfoques alternativos para las células y tejidos fraccionados, muchos son costo-prohibitivos, tediosos y / o requieren equipo de laboratorio no estándar. El presente método proporciona un procedimiento sencillo que enriquece las membranas crudas funcionales. Después de aislar MOR1, se determinaron diversas propiedades farmacológicas de su agonista, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) y antagonista, naloxona.
Introduction
Los receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) son una gran familia de receptores de la superficie celular responsables de una notable variedad de procesos fisiológicos, incluyendo analgesia, olfacción y comportamiento 1 . Los GPCR actúan detectando señales externas específicas y posteriormente estimulando la señalización intracelular. Por lo tanto, marcan una unión clave entre los entornos externos e internos de una célula. Debido al papel crítico que juegan los GPCR en la biología, se han convertido en objetivos principales tanto para la investigación básica como para el descubrimiento de fármacos 2 , 3 .
A diferencia de otras familias de receptores que se unen a ligandos discretos, los GPCR pueden unirse a tipos muy diferentes de moléculas. Mientras que un GPCR puede interactuar con péptidos, otro puede detectar fotones, pequeñas moléculas o iones 1 , 4 . Aunque sus ligandos son diversos, los GPCR se unifican en su arquitecto generalUre y función. Individual GPCRs se componen de siete α-helicoidal transmembrana proteínas con terminales extracelulares amino y intracelular carboxilo terminales [ 5 , 6] . GPCRs se acoplan a intracelulares G-proteínas heterotriméricas complejos de proteínas compuestas de α, β y γ subunidades-que median diversas vías de señalización [ 7] . La subunidad G $ α $ es una proteína de unión a nucleótidos de guanina que es inactiva cuando está unida a guanosina difosfato (GDP) y activa cuando está unida a guanosina trifosfato (GTP) 8,9. Cuando los GPCR se unen a sus ligandos, experimentan un cambio conformacional que permite que G $ α $ se disocie de G $ β $, permitiendo de este modo que G $ à $ cambie GDP por GTP $ TP $ . El propio receptor está fosforilado en su terminal carboxilo por varias serina / treónIne quinasas 10 , 11 e internalizadas para atenuar la señalización del receptor 12 , 13 , 14 . Mientras tanto, el monómero G α activado y el dímero G $ β $ proceden a activar vías de señalización distintas 7 . Existen varias isoformas de cada subunidad de proteína G, y cada isoforma se dirige a vías de flujo y sistemas de mensajero secundarios particulares. Las principales isoformas G $ s $ incluyen G $, $, G $ _ $, G $ _ { i } $ y G $ _ $ 12-13 . Típicamente, los GPCR individuales se asocian con una isoforma G α particular, uniendo así un estímulo externo a una respuesta celular específica 1 .
La caracterización de una interacción GPCR-ligando es crítica para entender la biología del receptor. Dado que el intercambio PIB / GTP es uno de los primerosNts que sigue la unión de ligando, el seguimiento de la unión a GTP puede medir la activación o inhibición de GPCR. Ensayar más eventos descendentes en la señalización de GPCR a menudo no es tan cuantitativa o estequiométrica, puede no distinguir agonistas completos de los parciales, y puede requerir reactivos costosos. Además, el aumento de la unión a GTP a las proteínas G α es un evento casi universal tras la activación de GPCR, lo que significa que la medición de la unión a GTP es un ensayo ampliamente aplicable para monitorizar la actividad de la mayoría de los GPCR. La medición de la unión a GTP es un método simple y rápido para monitorizar la señalización de GPCR en células que sobreexpresan el receptor de interés o en tejido nativo. El presente protocolo detalla un ensayo funcional de unión a GTP usando un GPCR arquetípico, el receptor opioide μ (MOR1), para determinar cuantitativamente la actividad de un agonista y antagonista en la señalización de GPCR.
Este protocolo describe primero cómo aislar las membranas crudas de las células que sobreexpresan MOR1. Tenga en cuenta queEste protocolo no se limita a sistemas de sobreexpresión y puede aplicarse a muchas fuentes de membrana, incluyendo tejido nativo o preparaciones que expresan múltiples receptores y proteínas G 15 . El protocolo entonces detalla cómo medir la unión de un análogo de GTP radiactivo a estas membranas en respuesta a concentraciones variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) o naloxona, un agonista y antagonista de MOR1, respectivamente. El análogo de GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), no es hidrolizable. Esta propiedad es crítica porque las subunidades G α exhiben actividad GTPasa intrínseca 7 y eliminaría el gamma fosfato marcado sobre un radioquímico GTP hidrolizable. Las membranas son entonces atrapadas sobre filtros de fibra de vidrio y lavadas, después de lo cual el GTP radiomarcado se cuantifica por recuento de centelleo líquido. Se pueden derivar múltiples parámetros farmacológicos para caracterizarE la interacción receptor-ligando, incluyendo la respuesta semimáxima (EC50) y el coeficiente de Hill (nH) para los agonistas y la concentración inhibitoria medio-máxima (IC50) y la constante de disociación de equilibrio (Kb) para los antagonistas 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo describe dos métodos separados pero complementarios: un enfoque sencillo para fraccionar células y tejidos en compartimentos amplios pero distintos y un medio para investigar la señalización de GPCR midiendo la unión de [35S] GTPγS.
El fraccionamiento celular eficiente tiene una amplia gama de aplicaciones, que van desde la extracción y enriquecimiento de proteínas, hasta la evaluación de la localización subcelular de proteínas, hasta el estudio de la farmaco…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la concesión nacional de los institutos de la salud DA-000266 y la concesión del programa de entrenamiento del científico médico C32 (CV, NWZ, y PCS). Los autores también quieren reconocer somersault18: 24 (somersault1824.com) para la Biblioteca de Ciencias y Ilustraciones Médicas.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
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