연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em> 체외에서</em
Summary
우리는 5- 메틸 시토신 (5-mC) 도트 블롯을 기반으로 DNA 메틸화를 정량화하는 방법을 제시합니다. 우리는 연골 세포 탈분화 동안 5-mC 수준을 결정했다. 이 간단한 기술은 ACI 치료에서 연골 세포 표현형을 신속하게 결정하는데 사용될 수 있습니다.
Abstract
섬유 연골 성 연골 세포로의 유리질 연골 세포의 탈 분화는 종종 체외에서 연골 세포의 단층 확장을 수반한다. 연골 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 표현형의 손실에 적합한 바이오 마커로 간주됩니다. 그러나 다른 실험 방법을 기반으로 한 결과가 일치하지 않을 수 있습니다. 그러므로 연골 세포의 탈분화 동안 전 세계적 DNA 메틸화 수준을 정량화하기위한 정확하고 간단하며 신속한 방법을 확립하는 것이 중요합니다.
현재의 게놈 전반의 메틸화 분석 기술은 주로 바이 설 파이트 게놈 시퀀싱에 의존합니다. 바이 설 파이트 전환 동안 DNA 분해로 인해, 이들 방법은 전형적으로 큰 샘플 체적을 필요로한다. 전반적인 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 데 사용되는 다른 방법으로는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 있습니다. 그러나, HPLC는 게놈 DNA의 완전한 소화가 필요합니다. 또한, HPLC의 비용이 엄청나게 높습니다.기구는 HPLC의 광범위한 적용을 제한합니다.
이 연구에서는 genomic DNA (gDNA)가 다양한 계대 배양으로 배양 된 인간 연골 세포로부터 추출되었다. gDNA 메틸화 수준은 메틸화 – 특이 적 도트 블롯 분석을 사용하여 검출되었다. 이 도트 블랏 접근법에서, 검출 될 메틸화 된 DNA를 함유하는 gDNA 혼합물을 이전에 그려진 원형 템플릿 패턴 내부의 도트로서 N + 막 상에 직접 점착시켰다. 다른 젤 전기 영동에 근거한 blotting 접근법과 다른 복잡한 blotting 절차와 비교하여, dot blot 방법은 상당한 시간을 절약합니다. 또한 도트 블랏은 상업적으로 이용 가능한 5-mC 항체를 사용하여 전체 DNA 메틸화 수준을 검출 할 수 있습니다. 우리는 DNA 메틸화 수준이 monolayer의 하위 문화 사이에 차이가 있음을 발견했으며, 따라서 연골 세포의 탈분화에 핵심적인 역할을 할 수있었습니다. 5-mC 도트 블랏은 일반 DNA 메틸화 수준을 평가하기위한 신뢰할 수 있고 간단하고 신속한 방법입니다e 연골 세포 표현형.
Introduction
Autologous chondrocyte implantation (ACI)은 관절 연골 결손을 치료하는 비교적 새로운 최첨단 절차입니다 1 , 2 . ACI의 중요한 단계 중 하나는 체외에서 단일 층 배양 을 통한 연골 세포의 증폭이다. 증폭 과정에서 유리 연골 세포는 쉽게 표현형을 잃어서 탈분화되어 ACI 치료에 바람직하지 못하다. ACI 치료의 결과를 최적화하기 위해, 연골 세포의 탈분화 정도를 재 접종 전에 결정해야합니다. 연골 세포의 상태를 결정하는 경제적이며 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 최근에 DNA 메틸화와 연골 세포 탈분극의 연관성이 주목을 받고있다 4 , 5 , 6 . DNA methylation은 wh의 과정이다.1 차 메틸기가 DNA에 추가되어 시토신 잔기가 5- 메틸 시토신 (5-mC)으로 전환됩니다.
연골 세포 탈분화의 DNA 메틸화 생물학을 밝히기 위해, 첫 번째 단계는 지금까지 도전적인 것으로 입증 된 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 평가하는 것입니다. Bisulfite 게놈 시퀀싱은 DNA 메틸화 분석에 가장 널리 사용되는 기술입니다 ( 7 , 8) . 이 분석에서 bisulfite 전환은 DNA 분해를 일으키므로 상당한 양의 시료를 분석에 제공해야합니다. 또한, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 전 지구 DNA 메틸화 수준 9 , 10 을 정량화하기 위해 사용되었습니다. 그러나 HPLC 분석에는 게놈 DNA 분해가 필요합니다. 또한, 고급 고비용 실험기구가 필요합니다. 따라서, 고비용 이외에, 이러한 실험 절차는 시간 단점음. 항 -m-5C 항체는 상업적으로 이용 가능하며, 복잡한 게놈으로부터의 5-mC- 함유 게놈 DNA의 면역 블 럿팅 가능성을 창출했다.
이 보고서에서 우리는 일련의 단층 배양에서 성장한 연골 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. 우리는 구절의 다른 번호와 인간의 연골 세포의 5-mC 콘텐츠를 평가하는 도트 블랏 분석을 사용합니다. 우리는 5-mC 함량이 낮은 등급의 탈분화를 가진 연골 세포에 비해 고도로 탈분화 된 연골 세포에서 증가한다는 것을 발견했다. 또한, 우리는 탈 분화 상태와 5-mC 수준 사이의 관계를 확인했습니다. 마지막으로 우리는 5-mC 함량의 변화가 연골 세포의 표현형과 관련이 있다고보고했다. 따라서 5-mC 도트 얼럿 분석은 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 검출하기위한 신뢰할 수있는 간단하고 신속한 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외에서 연골 세포 의 탈분화는 연골 결손의 치료에서 ACI의 결과를 심각하게 손상시킵니다 11,12. ACI 결과를 최적화하기 위해서는 탈분극 된 연골 세포 13 의 사용을 피하는 것이 중요합니다. 연구에 따르면 일반적인 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 탈분화의 정도와 관련이 있다고합니다. 따라서, 임상 적용 전에 연골 세포의 일반적인 DNA 메틸화 상태를 검출하는 신뢰성 있고 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 다음과 같은 교부금에 의해 지원되었다 : 중국 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); 광동성 자연 과학 재단, 중국 (No. 2015A030313772); 중국 박사후 연구 재단 기금 프로젝트 (No. 2013M530385); 중국 광동성의 의학 연구 재단 (No. A2016314); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
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