में शीत Nociception के लिए उपन्यास परख<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा
Summary
यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा में ठंड nociception अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास परख का प्रदर्शन। यह परख एक कस्टम निर्मित पेल्टियर जांच एक केंद्र हानिकारक ठंड उत्तेजना को लागू करने में सक्षम का इस्तेमाल करता है और मात्रात्मक ठंड में विशिष्ट व्यवहार का परिणाम है। इस तकनीक को ठंड nociception के आगे सेलुलर और आणविक विच्छेदन की अनुमति देगा।
Abstract
कैसे जीवों भावना और अभी भी बुरा समझा जाता है हानिकारक तापमान का जवाब। इसके अलावा, इस तरह के अंतर्निहित परिधीय न्युरोपटी या चोट प्रेरित संवेदीकरण का सामना कर रोगियों में के रूप में संवेदी मशीनरी का संवेदीकरण, तंत्र, अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं। आनुवंशिक रूप से विनयशील ड्रोसोफिला मॉडल, कोशिकाओं और जीन हानिकारक गर्मी का पता लगाने के लिए आवश्यक अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो ब्याज के कई संरक्षित जीन सामने आए हैं। लिटिल कोशिकाओं और हानिकारक ठंड संवेदन के लिए महत्वपूर्ण रिसेप्टर्स के बारे में हालांकि जाना जाता है। हालांकि, ड्रोसोफिला ठंडे तापमान (≤10 ºC) करने के लिए लंबे समय तक जोखिम जीवित नहीं है, और शांत से बचने जाएगा, व्यवहार वरीयता assays, वे कैसे समझ में गर्म तापमान पसंद करते हैं और संभवतः से बचने के हानिकारक ठंड उत्तेजनाओं हाल ही में जांच की गई है।
यहाँ हम वर्णन और में पहली हानिकारक ठंड (≤10 ºC) व्यवहार परख की विशेषताएँड्रोसोफिला। इस उपकरण और परख का उपयोग करना, हम एक अन्वेषक कैसे गुणात्मक और मात्रात्मक ठंड nociceptive व्यवहार का आकलन करने के दिखा। यह रोग, चोट या संवेदीकरण के संदर्भ में सामान्य / स्वस्थ संस्कृति शर्तों के तहत किया जा सकता है, या शायद। इसके अलावा, यह परख वांछित जीनोटाइप हैं जिन्हें thermosensation, दर्द या nociceptive संवेदीकरण प्रभाव हो सकता है के लिए चुना गया लार्वा के लिए लागू किया जा सकता है। यह देखते हुए दर्द एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है कि, इस परख का उपयोग कर आगे थर्मल nociception अध्ययन करने के लिए की संभावना रीढ़ सहित अन्य प्रजातियों, में दर्द प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण समझ बटोरने होंगे।
Introduction
ड्रोसोफिला उपन्यास संरक्षित जीन और neuronal सर्किट है कि जटिल व्यवहार आबाद की पहचान के लिए अत्यधिक उपयोगी साबित हो गया है। मक्खियों एक परिष्कृत आनुवंशिक टूलकिट और एक सरलीकृत तंत्रिका तंत्र कि nociception 5, 6, 7 के सेलुलर और आणविक ठिकानों काटना सटीक आनुवंशिक और न्यूरोनल हेरफेर 1, 2, 3, 4 के लिए अनुमति प्रदान करते हैं। लार्वा इन विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, कोमल स्पर्श 8, 9, 10, हानिकारक गर्मी 11, 12, 13 और हानिकारक उत्तेजनाओं 4 के यांत्रिक सनसनी के लिए व्यवहार assays कि दिए गए, </sup> 11 पहले से ही स्थापित किया गया है, और पारदर्शी लार्वा छल्ली एपिडर्मिस और अंतर्निहित संवेदी न्यूरॉन्स की लाइव या निश्चित इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। हाल ही में, हानिकारक सर्दी के लिए एक परख भी 7 है, जो हम यहाँ और अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है।
एक ठीक, शंक्वाकार-टिप ठंड जांच का उपयोग करना, हम बताते हैं कि ड्रोसोफिला लार्वा प्रदर्शनी ठंड में विशिष्ट प्रतिक्रियाशील व्यवहार का एक सेट, सामान्य हरकत के दौरान मनाया व्यवहार, कोमल स्पर्श निम्नलिखित से अलग, या कठोर यांत्रिक या उच्च तापमान उत्तेजनाओं 7, 8 के बाद, 11 । ठंड में विशिष्ट व्यवहार एक मजबूत पूरे शरीर संकुचन (सीटी), पीछे खंडों (पीआर) और पूर्वकाल की एक साथ उठाने और पीछे खंडों को यू-आकार (अमेरिका) में की 45-90º बढ़ाने शामिल हैं। इन कार्यों के प्रसार को कम तापमान लेकिन रों में प्रत्येक चोटियों के साथ बढ़ जाती हैहल्के से अलग ठंडे तापमान। हाल के काम चलता है कि सीटी प्रतिक्रियाओं उन है कि हानिकारक गर्मी या कठोर यांत्रिक उत्तेजनाओं 7 का जवाब की तुलना में अलग परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे।
बहुत हड्डीवाला nociceptors की तरह, ड्रोसोफिला कई वृक्ष के समान (एमडी) परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स जटिल वृक्ष के समान संरचनाओं कि एपिडर्मिस 1 से अधिक arborize है। md न्यूरॉन्स उदर तंत्रिका कॉर्ड 14 करने के लिए उनके एक्सोन पेश हर लार्वा शरीर खंड में मौजूद हैं,। md संवेदी न्यूरॉन्स चार अलग अलग वर्गों (मैं IV) वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के आधार पर में विभाजित हैं और संवेदी कार्यों 4, 9, 10, 15, 16, 17 अलग-अलग है। चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स लार्वा पार्श्व शरीर रोल प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं जबकिउच्च तापमान या कठोर यांत्रिक उत्तेजनाओं 4, वर्ग के लिए तृतीय न्यूरॉन्स कोमल स्पर्श प्रतिक्रियाओं 9, 10 के लिए आवश्यक हैं और केवल ठंड से सक्रिय नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी ठंड में पैदा व्यवहार प्रतिक्रियाओं 7 के लिए आवश्यक हैं। दोनों वर्ग तृतीय और चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स हानिकारक 7, 11, 18 और गैर हानिकारक उत्तेजनाओं 9, 10, 17, 19 के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं की सुविधा के लिए असतत क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपी) चैनलों का उपयोग। इसके अलावा, लार्वा nociception निम्नलिखित चोट अवगत है, सेलुलर 20 और व्यवहार के स्तर को 12, 21 पर।
परख यहाँ वर्णित quantificatio लिए अनुमति देता हैया तो सामान्य, या संभवतः के n (≤ 10 ºC) हानिकारक ठंड से लेकर ठंडे तापमान, अहानिकर शांत (11-17 ºC) को व्यवहार प्रतिक्रियाओं बदल, परिवेश तापमान (18-22 ºC) करने के लिए। ठंड इस परख में इस्तेमाल किया तापमान सीधे, वर्ग तृतीय संवेदी न्यूरॉन्स को सक्रिय मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कैल्शियम बढ़ जाती है और ठंड में पैदा व्यवहार प्रतिक्रियाओं, जो गुणात्मक हो सकता है और मात्रात्मक 7 विश्लेषण किया eliciting में सक्षम हैं। यह परख (बदल पोषण, चोट औषधीय एजेंटों) विविध पर्यावरण की स्थिति से अवगत कराया लार्वा दोनों आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि ठंड nociception, nociceptive संवेदीकरण या nociceptive प्लास्टिसिटी प्रभाव का निर्धारण करने के लिए और साथ ही वास्तव में किसी भी जीनोटाइप के लार्वा के लिए लागू किया जा सकता है। यह देखते हुए कि thermosensation कई प्रजातियों भर में हर जगह है, इस परख nociception के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है और उपन्यास जीन लक्ष्य या neuronal बातचीत है कि सुधार होगा उजागर कर सकते हैंकशेरुकी nociception की हमारी समझ।
कस्टम निर्मित ठंड जांच (ठंड जांच, सामग्री की तालिका देखें) एक बंद लूप तापमान पेल्टियर डिवाइस है, जो थर्मल चालन के माध्यम से एल्यूमीनियम शाफ्ट और शंक्वाकार टिप ठंडा नियंत्रित इस्तेमाल करता है। एक thermistor एल्यूमीनियम शंक्वाकार नोक अंदर एम्बेडेड है नियंत्रण इकाई पर वास्तविक समय तापमान की रिपोर्ट। एक हीट सिंक और प्रशंसक (थर्मल नियंत्रण इकाई, सामग्री की तालिका देखें) पेल्टियर प्रभाव की गर्मी लोड (QC) तो (22-0 डिग्री सेल्सियस) के वांछित तापमान रेंज प्राप्त किया जा सकता विनियमित करने के लिए ताप विद्युत मॉड्यूल से जुड़े होते हैं। ठंड जांच टिप के हानिकारक ठंड प्रोत्साहन खंड (रों) पूर्वकाल और पीछे छोर से समान दूरी पर करने के लिए, पृष्ठीय मध्य रेखा के हाथ से लागू किया जाता है लार्वा के (मोटे तौर पर खंड ए 4, चित्रा 1 ए देखें)। ठंड उत्तेजनाओं के जवाब में, लार्वा आम तौर पर एक 10 एस कटऑफ के भीतर तीन ठंड में पैदा व्यवहार में से एक का उत्पादन: पूरे शरीरसंकुचन (सीटी), यू-आकार (अमेरिका), या पीछे खंडों (पीआर) (परिणाम में वर्णित) के एक बढ़ाने में पूर्वकाल और पीछे खंडों के एक 45-90º बढ़ाने। इन कार्यों में से कोई भी सामान्य क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला हरकत या खाना ढूंढना व्यवहार के दौरान प्रदर्शन कर रहे हैं। इन कार्यों भी कोमल स्पर्श प्रतिक्रियाओं और उच्च तापमान या हानिकारक यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रतिकूल रोलिंग प्रतिक्रिया से भिन्न हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित परख गुणात्मक और मात्रात्मक विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, पर्यावरणीय प्रभावों, और / या क्षति प्रेरित स्थिति के लार्वा में nociception या nociceptive संवेदीकरण का आकलन किया जा सकता है। चूंकि यह परख एक ठंडा उ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए ठंड जांच परख, मक्खी शेयरों के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र, और Galko प्रयोगशाला के सदस्यों के प्रारंभिक चरणों के विकास के लिए सारा वू और केमिली ग्राहम धन्यवाद। इस काम एनआईएच एनआरएसए (एनआईएच F31NS083306) HNT करने के लिए, द्वारा और एनआईएच R01NS069828, R21NS087360 और MJG के लिए मूल अनुसंधान में टेक्सास एमडी एंडरसन क्लार्क फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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