Novel analyse for Cold nociception i<em> Drosophila</em> Larver

Summary

Her viser vi en ny analyse for å studere kaldt nociception i Drosophila larver. Denne analysen anvender et spesialbygd Peltier sonde stand til å påføre en fokal skadelig kald stimulus og resulterer i kvantifiserbare kald spesiell oppførsel. Denne teknikken vil tillate ytterligere cellulære og molekylære disseksjon av kald nocicepsjon.

Abstract

Hvordan organismer oppfatte og svare på skadelige temperaturer er fortsatt dårlig forstått. Videre er mekanismene bak sensibilisering av sensoriske maskineri, slik som hos pasienter med perifer nevropati eller skader indusert sensitivering, er ikke godt karakterisert. Den genetisk medgjørlig Drosophila modell er blitt brukt til å studere celler og gener som er nødvendige for skadelige varmedetektor, som har gitt multiple konserverte gener av interesse. Lite er kjent om imidlertid cellene og reseptorer er viktige for skadelige kald avføling. Selv om Drosophila ikke overleve langvarig eksponering for kulde (≤10 ° C), og vil unngå kjølig, og foretrakk varmere temperaturer i atferdspreferanse analyser, hvordan de føler og muligens unngå skadelige kalde stimuli har nylig blitt undersøkt.

Her beskriver vi og karakter den første skadelige kaldt (≤10 ºC) atferdsanalyse iDrosophila. Ved hjelp av dette verktøyet og analysen viser vi en etterforsker hvordan kvalitativt og kvantitativt vurdere kalde nociceptive atferd. Dette kan gjøres ved vanlige / sunne dyrkningsbetingelser, eller antagelig i sammenheng med sykdom, skade eller sensibilisering. Videre kan denne analysen anvendes for å larver valgt for ønskede genotyper, noe som kan påvirke thermosensation, smerte eller nociseptiv sensibilisering. Gitt at smerte er en svært konservert prosess, ved hjelp av denne analysen for å studere termisk nocisepsjon sannsynligvis vil fange opp viktige forståelse av smerte prosesser i andre arter, inkludert virveldyr.

Introduction

Drosophila har vist seg å være svært nyttig for identifisering av nye konserverte gener og neuronal kretser som ligger til grunn komplekse problemer. Fluer tilveiebringe en sofistikert genetisk verktøykasse og et forenklet nervesystemet som gir mulighet for nøyaktig genetisk manipulasjon og neuronal ^{1, 2, 3, 4} for å dissekere de cellulære og molekylære baser av nociception ^{5, 6, 7.} Larver er spesielt nyttig for disse analysene, gitt at atferdsmessige analyser for svak berøring ^{8, 9, 10,} skadelige varme ^{11, 12, 13} og mekanisk følelse av skadelige stimuli ^4, </sup> ¹¹ allerede har blitt etablert, og den gjennomsiktige larve hårstråene gjør det mulig for levende eller fast avbildning av overhuden og underliggende sensoriske nevroner. Nylig har en analyse for skadelige kaldt også utviklet ^7, som vi beskriver i mer detalj her.

Ved hjelp av en fin, konisk tupp kald probe, viser vi at Drosophila larver oppviser et sett av kald-spesifikt reaktive oppførsel, forskjellig fra oppførsel observert under normal bevegelse, etter svak berøring eller etter hard mekanisk eller høy temperatur stimuli ^{7, 8, 11} . De kalde spesifikke atferd omfatter en robust hele kroppen kontraksjon (CT), en 45-90º høyning av de bakre segmenter (PR) og en samtidig heving av fremre og bakre segmenter inn i en U-form (US). Forekomsten av disse problemene øker med synkende temperatur, men hver topper ved slett forskjellige kalde temperaturer. Nylige studier tyder på at CT-responser blir formidlet av forskjellige perifere sensoriske neuroner enn de som reagerer på skadelig varme eller sterke mekaniske stimuli ^7.

Mye som virveldyr nociseptorer, Drosophila multiple dendrittisk (md) perifere sensoriske neuroner har komplekse dendrittiske strukturer som arborize gjennom epidermis ^1. md neuroner er til stede i hver larvehylstersegment som rager sine aksoner til den ventrale nerve ledningen ^14. md sensoriske neuroner er delt inn i fire forskjellige klasser (I-IV) på basis av dendrittiske morfologi og har varierende sensoriske funksjoner ^{4, 9, 10, 15, 16, 17.} Mens klasse IV neuroner er nødvendig for larvesideveis krengning responserfor høy temperatur eller harde mekaniske stimuli ^4, klasse III neuroner er nødvendig for svak berøring responser ^{9, 10} og ikke bare aktiveres av kulde, men også er nødvendig for den kalde-fremkalte atferdsmessige responser ^7. Både Klasse III og klasse IV neuroner anvende diskrete forbigående reseptor potensiale (TRP) kanaler for å lette atferdsmessige respons på skadelig ^{7, 11, 18} og ikke-skadelige stimuli ^{9, 10, 17, 19.} Videre er larve nocicepsjon sensitivert etter skade, på celle ²⁰ og atferdsmessige nivåer ^{12, 21.}

Analysen beskrevet her gjør det mulig for den quantification av enten normal eller potensielt forandres atferdsmessige responser for lave temperaturer som strekker seg fra skadelige kald (≤ 10 ° C), ufarlige kule (11-17 ° C), til omgivelsestemperatur (18-22 ° C). De lave temperaturene som anvendes i denne analysen er i stand til direkte å aktivere klasse III sensoriske neuroner, utløsning av robuste, reproduserbare kalsium øker og kald-fremkalte atferdsmessige responser, som kan være kvalitativt og kvantitativt analysert ^7. Denne analysen kan brukes til larver av praktisk talt hvilken som helst genotype så vel som til larvene utsettes for forskjellige miljøforhold (endres ernæring, skader, farmakologiske midler) for å bestemme både genetiske og miljømessige faktorer som påvirker kald nociception, nociceptiv sensibilisering eller nosiseptiv plastisitet. Gitt at thermosensation er allestedsnærværende i mange arter, gir denne analysen et verdifullt verktøy for studier av nocicepsjon og kan avdekke nye genmål eller neuronal interaksjoner som vil forbedrevår forståelse av virveldyr nociception.

Den spesialbygde kald probe (se kald probe, Table of Materials) benytter en lukket sløyfe temperaturkontrollert Peltier-enhet, som kjøler aluminium akselen og den koniske spiss gjennom varmeledning. En termistor er innkapslet i den aluminium koniske spiss rapporterer sanntid temperatur på styreenheten. En kjøleribbe og vifte er festet til den termoelektriske modul for å regulere den Peltier-effekten varmebelastning (Qc) slik at den ønskede temperaturområdet (22-0 ° C) kan oppnås (se Thermal Control Unit, Table of Materials). Den kalde skadelig stimulus av den kalde sondespissen påføres for hånd til dorsal midtlinjen, for å segment (er) i samme avstand fra fremre og bakre ender (omtrent segment A4, se figur 1A) av larven. Som svar på kalde stimuli, larver produserer generelt en av tre kald-fremkalt adferd innen 10 s cutoff: en full kroppskontraksjon (CT), en 45-90º høyning av fremre og bakre segmenter inn i en U-form (USA), eller en høyning av de bakre segmentene (PR) (beskrevet i resultater). Ingen av disse atferd utføres under normal peristaltiske bevegelse eller foraging atferd. Denne oppførselen er også forskjellig fra svak berøring responser og motvilje rullende respons på høy temperatur eller skadelige mekaniske stimuli.

Protocol

1. Fremstilling av larver Hev aksjer eller genetiske krysninger i en 25 ° C inkubator. Ved dyrking av et kors, bruke 20-25 jomfrue hunner og hanner 15-20 per ampulle inneholdende vanlig maismel fluemateriale. Tillate kvinner å legge egg i ca 48 timer før de overføres til en ny beholder med mat. 4-5 dager etter egg lay, samle 3. stadiums larver av den ønskede genotype ved forsiktig sprut en strøm av vann inn i bløt mat og larver, og helle ut innholdet i en middels…

Representative Results

Drosophila larver beveger seg med en peristaltisk bevegelse som inkluderer tilfeldige pauser, hodebevegelser, og endringer i retning 22. Som svar på fokal påføring av et skadelig stimulus kald imidlertid larver oppviser et sett med unike oppførsel, i motsetning motvilje laterale rull til skadelig varme og mekaniske stimuli. Denne oppførselen er også forskjellig fra responsene til svak berøring 8, <sup class="xref"…

Discussion

Analysen som er beskrevet her kan anvendes for å kvalitativt og kvantitativt vurdere nocisepsjon eller nociseptiv sensibilisering hos larver av forskjellige genetiske bakgrunner, miljøpåvirkninger, og / eller skade-induserte tilstander. Etter denne analysen muliggjør for fokal anvendelse av en kald stimulus, med dette verktøyet kan en fastsette funksjonen av en undergruppe av perifere sensoriske neuroner spesielt i å svare på kalde temperaturer. Interessant disse kalde-fremkalt atferd synes å utnytte forskjellig…

Materials

Cold Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit	TE Technology	Custom Built enclosure	Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries.	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott North America, Inc.	Schott A08575
Forceps	FST	FS-1670	Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon	351008
60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish				Falcon	351007
Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches)			Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q	Used to move food
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture