Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Summary

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Abstract

ingeniería de genes en embriones de ratón o células madre embrionarias (mESCs) permite el estudio de la función de una proteína dada. Las proteínas son los caballos de batalla de la célula y a menudo consisten en varios dominios funcionales, que pueden ser influenciados por modificaciones posteriores a la traducción. El agotamiento de la proteína completa en ratones condicional o constitutiva knock-out (KO) no tiene en cuenta esta diversidad funcional y la regulación. se informó previamente Una línea mESC y un modelo de ratón derivada, en la que se insertó un sitio de acoplamiento para FLPe intercambio casete de recombinación mediada (RMCE) dentro del locus ROSA26 (R26),. Aquí, se presenta en un enfoque de estructura-función que permite la disección molecular de las distintas funcionalidades de una proteína multidominio. Con este fin, los ratones compatible-RMCE deben ser cruzadas con ratones KO y mESCs KO compatibles RMCE-a continuación deben ser aislados. A continuación, un panel de construcciones de rescate putativos se puede introducir en el locus R26 a través de RMCE targeting. Los ADNc de rescate candidatos se pueden insertar fácilmente entre sitios RMCE de los ataques de vectores de clonación que utilizan la recombinación. A continuación, mESCs KO se transfectan con el vector de direccionamiento en combinación con un plásmido de expresión de la recombinasa FLPe. RMCE reactiva el gen de resistencia a neomicina sin promotor en los sitios de acoplamiento ROSA26 y permite la selección del evento orientación correcta. De esta manera, se obtienen altas eficiencias de focalización cercanos al 100%, lo que permite la inserción de múltiples construcciones de rescate putativo de una manera semi-alto rendimiento. Por último, una multitud de construcciones de rescate impulsadas-R26 puede ser probado por su capacidad para rescatar el fenotipo que se observó en mESCs KO parentales. Presentamos un estudio de estructura-función de prueba de principio en la catenina p120 (p120ctn) mESCs KO utilizando la diferenciación del endodermo en cuerpos embrioides (EBS) como la lectura fenotípica. Este enfoque permite la identificación de dominios importantes, las vías aguas abajo putativo, y el punto de enfermedad relevantemutaciones que subyacen fenotipos KO para una determinada proteína.

Introduction

Se estima que los genomas de mamíferos contienen alrededor de 20.000 genes codificadores de proteínas. Splicing alternativo y modificaciones postraduccionales aumentan aún más el repertorio de proteínas. Las proteínas tienen una estructura modular ¹ y a menudo contienen varios dominios de interacción, que permiten su reclutamiento en diferentes complejos de proteínas y su participación en múltiples procesos celulares ^2. Un ejemplo es la proteína multifuncional llamada p120ctn. p120ctn está codificada por el gen Ctnnd1 y consta de un gran dominio central armadillo repetición flanqueado por un N-terminal y una región C-terminal. El dominio armadillo de p120ctn se une a un dominio yuxtamembrana altamente conservada de cadherinas clásicas, que están implicadas en la adhesión célula-célula, pero también se une al represor transcripcional Kaiso. El dominio N-terminal de p120ctn interactúa con diferentes quinasas, fosfatasas, pequeñas RhoGTPases, y asociada a los microtúbulos proteins ^3. Curiosamente, como resultado de corte y empalme alternativo, isoformas p120ctn pueden ser generados a partir de cuatro codones de inicio alternativos ^4. p120ctn isoforma 1A es la más larga, ya que se traduce de la más-5' codón de inicio y contiene el segmento N-terminal de longitud completa. En p120ctn isoformas 3 y 4, este segmento N-terminal se suprime parcialmente y completamente, respectivamente. La comprensión del papel exacto de proteínas (o isoformas de proteínas) y sus dominios en diferentes funciones celulares sigue siendo un reto.

La orientación de genes en mESCs permite el estudio de la función de una proteína a través de la supresión genética del gen correspondiente y ha contribuido ampliamente a la identificación de genes y las vías de desarrollo importantes y relevantes de la enfermedad. Este avance en la genética inversa fue el resultado de los avances en los campos de aislamiento mESC y la orientación de genes debido a la recombinación homóloga ⁵ </sarriba>. La recombinación homóloga es un proceso en el que fragmentos de ADN se intercambian entre dos restos nucleicos similares o idénticos después de doble hebra (ds) se rompe de ADN. Normalmente, HR es ineficiente debido a roturas de ADN bicatenario son poco frecuentes. Recientemente, la eficiencia del gen homología dirigida de orientación podría aumentarse usando nucleasas específicas de sitio ^{6, 7,} pero, por desgracia, estos son propensos a los efectos fuera del objetivo ^8. Una técnica más fiable para permitir la orientación de genes es RMCE, que se basa en los sistemas de recombinación específica de sitio tales como Cre / loxP o FLPe / FRT. LoxP y la secuencia Frt se encuentran en bacteriófago P1 y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente, y se componen de 34 pares de bases, incluyendo una secuencia de pares de bases asimétrica 8 que determina la orientación del sitio. Por otra parte, la orientación de, por ejemplo, dos sitios loxP dentro de un tramo de ADN determinará si el ADN floxed convierte escindió o inversed tras la recombinación mediada por Cre ^9. Por otra parte, Cre también puede inducir una translocación si dos sitios están localizados en diferentes cromosomas. RMCE se aprovecha de sitios de recombinación heterospecific que no reaccionan de forma cruzada y que están incrustados en un locus genómico. En presencia de un plásmido donante que contiene un fragmento de ADN flanqueado por los mismos sitios heterospecific, la recombinasa se insertar este fragmento de ADN en el locus genómico compatible-RMCE debido a la translocación de doble simultáneo (Figura 1). Aquí, los clones solamente correctamente orientados RMCE pueden hacer de resistencia a fármacos gracias a un promotor en el vector entrante que restaura una "atrapado" promotor-menos gen de resistencia a neomicina (Neo ^R) presente en el genoma R26 de las células de conexión (Figura 1) ^{10, 11.} Esto resulta en una eficiencia muy alta focalización, a menudo cerca de 100% ^{11, <}/ sup> ^12. En conclusión, la selección de base RMCE es altamente eficiente y se puede utilizar para estudios de estructura-funciones; sin embargo, se requiere un locus genómico pre-ingeniería.

Figura 1. Representación esquemática de la orientación de RMCE mediada. RMCE permite el intercambio de segmentos de ADN a partir de un vector de dirección entrante a un locus genómico definido si ambos albergan dos sitios FRT heterospecific (representados por triángulos blanco y rojo). Además, el locus genómico de ingeniería contiene un gen truncado de resistencia a neomicina (Neo ^R) sin promotor y. Al proporcionar un promotor y el codón de inicio en el fragmento de ADN entrante, eventos de recombinación solamente correctas restaurar la resistencia a neomicina, dando como resultado altas eficiencias de focalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de tsu figura.

la ingeniería del genoma en mESCs permite la generación de ratones compatible-RMCE. En 1981, dos grupos tuvieron éxito en la captura de células pluripotentes de la masa celular interna (ICM) de blastocistos y en el mantenimiento de ellos en la cultura ^{13, 14.} mESCs son capaces de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos de células embrionarias y adultas, incluyendo el linaje de células germinales. Por lo tanto, la orientación de genes en mESCs permite estudios inversa genéticos mediante el desarrollo de ratones KO constitutivos o condicionales (utilizando el sistema cre / loxP). Sin embargo, la manera clásica para aislar células ES de ratón es muy ineficiente. Varias mejoras importantes han aumentado en gran medida la tasa de éxito para derivar líneas mESC, incluyendo el uso de un suero de reemplazo definido (SR) medio ^15, alternando entre medio mESC que contenía suero bovino SR y fetal (FBS) ^16, y el uso de fármacocompuestos lógicos como pluripotin o 2i ^17. Pluripotin, una molécula sintética pequeña, permite la propagación de mESCs en un estado no diferenciado en ausencia del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) ^18. Por último, se ha demostrado que mESCs se pueden aislar con una eficacia muy alta (cerca de 100%) cuando un / FBS protocolo alternancia medio SR se combina con LIF y pluripotin ^{19, 20.} Estos protocolos permiten el aislamiento eficiente de mESCs KO compatible con RMCE que posteriormente pueden ser utilizados para estudios de estructura-función.

Este documento describe un método que permite identificar los dominios o residuos clave dentro de una proteína que son responsables de los procesos celulares específicos. Con este fin, una línea de tecnologías avanzadas que permiten el aislamiento eficiente mESC, montaje vector de dirección y orientación mESC era crearre. Como tales paneles grandes, con isoformas de proteínas, mutantes de dominio, y efectores aguas abajo pueden ser introducidas en mESCs KO y se pueden evaluar por su capacidad para rescatar el fenotipo vitro KO en.

Protocol

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las normas de origen animal institucionales, nacionales y europeas. 1. Aislamiento de mESCs KO compatibles con RMCE Breed ratones KO heterocigóticas con ratones compatible-RMCE, tales como ratones ROSALUC 10 o ratones ROSA26-iPSC 21. Ambos ratones compatibles con RMCE se mantuvieron en un / fondo mixto 129 C57BL6 / suizo. NOTA: Al cruzar con ratones KO heterocigóticos se recomi…

Representative Results

El procedimiento para aislar líneas KO mESC compatible-RMCE se representa en la Figura 2. Se requieren dos crías consecutivos para obtener blastocistos KO compatible con RMCE. En primer lugar, los ratones KO heterocigóticos se cruzaron con los ratones compatibles con RMCE obtener, ratones KO heterocigóticos compatible con RMCE. Estos ratones se usan entonces para apareamientos programados con otros ratones KO heterocigóticas para obtener 3,5-dpc, compatible-RMCE, bl…

Discussion

Nuestro método de aislamiento mESC es fácil de usar y no requiere de técnicas y equipos avanzados, tales como la microcirugía de los blastocistos. Por lo tanto, esta tecnología se puede acceder a una gran parte de la comunidad científica. Cualquier persona con experiencia básica cultivo celular puede propagarse excrecencias ICM y establecer líneas mESCs. Sin embargo, el enrojecimiento y la manipulación de los blastocistos requiere algo de práctica. Una pipeta boca se utiliza para transferir los blastocistos y …

Materials

ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles	Fine-ject	8697
1-ml syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment:
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media:
MEF Medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR )	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386