des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
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Article de méthode
Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à la réplication d'une variété de différents agents pathogènes, le plus en évidence le virus de l'hépatite C (VHC), comme le site présumé de virion morphogenèse. analyse des gouttelettes de lipide protéome quantitative peut être utilisée pour identifier les protéines qui se localisent à ou sont déplacés à partir de gouttelettes lipidiques dans des conditions telles que les infections virales. Nous décrivons ici un protocole qui a été utilisé avec succès pour caractériser les changements dans le protéome des gouttelettes de lipides après infection par le VHC. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) et l'étiquette ainsi le protéome complet d'une population de cellules avec des acides « lourds » acides pour quantifier les protéines par spectrométrie de masse. Pour l' isolation des gouttelettes de lipides, les deux populations de cellules ( par exemple le VHC infectés / acides aminés « légers » et témoins non infectés / acides aminés « lourds ») sont mélangés à 1: 1 et lysées mécaniquement dans un tampon hypotonique. Après avoir enlevé les noyaux et cellules debris par centrifugation à basse vitesse, les protéines de gouttelettes lipidiques associée sont enrichies par deux étapes d'ultracentrifugation ultérieures suivies de trois étapes de lavage dans un tampon isotonique. La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques est analysé par transfert de type western avec des anticorps reconnaissant les différents compartiments subcellulaires. protéines associées à des gouttelettes lipidiques sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. Après digestion trypsique, les peptides sont quantifiés par spectrométrie de masse Chromatographie liquide-électrospray-tandem à ionisation (LC-ESI-MS / MS). En utilisant cette méthode, nous avons identifié des protéines recrutées à des gouttelettes lipidiques sur l'infection par le VHC qui pourraient représenter des facteurs d'accueil pro- ou anti-viraux. Notre méthode peut être appliquée à une variété de différentes cellules et conditions de culture, telles que l'infection par des agents pathogènes, stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
Introduction
Les gouttelettes lipidiques sont des organelles cellulaires hautement cytoplasmiques (et nucléaires) dynamique composé d'un noyau de lipides neutres (triglycérides (TG) et l' ester de cholestérol (CE)) entourée par une monocouche de phospholipides avec des protéines intégrées 1. Tous les types de cellules produisent des gouttelettes lipidiques, mais ils varient en taille, la composition des lipides, et la décoration des protéines. Les gouttelettes lipidiques remplissent diverses fonctions, notamment comme réservoirs d'énergie et d'un précurseur de membrane ou en tant que dépôts de protéines. De plus, grâce à l'absorpt....
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Protocole
1. Préparation des médias pour l'étiquetage des Isotopes Stables avec des acides aminés dans la culture cellulaire (de SILAC)
REMARQUE: Ici, la Quantification protéine SILAC Kit - DMEM complété avec 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl a été utilisé pour l' étiquetage des SILAC. Le sérum de veau foetal dialysé (FCS) est fourni avec la protéine Kit Quantification de SILAC.
- Retirer 50 ml de chaque bouteille de milieu DMEM et ajouter 50 ml de FCS dialysé.
- Dissoudre 50 mg de 13 C 6 L-Lysine-2HCl et 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl dans 1 ml de milieu. Bien ....
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Résultats
Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à l'infection par le VHC que les sites présumés de l'assemblage des virions, mais les mécanismes moléculaires de la morphogenèse et la sortie de virions sont en grande partie inconnus. Identifier les facteurs de dépendance hôte nouveaux impliqués dans ce processus, nous avons effectué une analyse quantitative du protéome des gouttelettes de lipides des cellules infectées par le VHC-21 (Figure 1A).
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour isoler des gouttelettes lipidiques pour l'analyse du protéome des gouttelettes de lipides quantitative pour comparer l'enrichissement et l'appauvrissement des protéines associées à des gouttelettes lipidiques dans des conditions de culture diverses, telles que les infections virales. En tant que méthode alternative, l'analyse du protéome peut être réalisée avec quantifications sans étiquette basée sur l'intensité totale des pics. Cette méthode n'a aucune limit.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous remercions R. Bartenschlager (Université de Heidelberg) pour les constructions jc1, CM Riz (Université Rockefeller) pour les cellules Huh7.5, J. McLauchlan (Conseil de recherches médicales Virologie) pour la construction JFH1, T. Wakita (Institut national de la Maladies infectieuses, Japon) pour le JFH1, et B. Webster et WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) pour les constructions rapporteurs HCVcc. Ce travail a été financé par des fonds de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 et INST 337 / 16-1 2013 (SH)). L'Institut Heinrich Pette, Institut Leibniz pour Experimental Virology est pris en charge par la Ville libre et hanséati....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kit de Quantification des Protéines SILAC - DMEM | Thermo Fisher | 89983 ; | |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 ; mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Concentré | Roth GmbH | A152.2 ; | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Tampon | Geyer Th. GmbH & Co.KG ; | A1415,0250 ; | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH ; | 350500038 | |
| Solution de pénicilline/streptomycine pour la culture cellulaire | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | P4333-100ml ; | |
| DPBS 1x Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | D8537 ; | |
| Trypsine-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | T3924-100ML ; | |
| Chlorure de sodium BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure ; ; | AppliChem GmbH | A1086,5000A ; | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | P8340-5ML ; | |
| D(+)-Saccharose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Acide chlorhydrique (HCl) pur à 37 % Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC Dosage des protéines ; | Bio-Rad Laboratoris GmbH ; | 500-0116 ; | |
| Glycérol | AppliChem GmbH | 151339 | |
| FDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Bleu de bromophénol | AppliChem GmbH | A2331 | |
| &beta ;-Mercaptoéthanol ; | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Blasticidine | Invivogen | ant-bl-1 ; | |
| Chlorure de potassium | AppliChem | GmbH A1039 | |
| Fluorure de phénylméthanesulfonyle ; | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | ||
| Hydrogénophosphate dipotassique | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | P3786 ; | |
| DTT ; | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Lait écrémé en poudre en poudre | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP ; | abcam | AB52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 & micro ; g | abcam | ab47639 | |
| Calréticuline, pAb 200 & micro ; g | Enzo Life Science GmbH ; | ADI-SPA-600-F ; | |
| Anti-&bêta ;-tubuline ; | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | T6074 200µ ; l ; | |
| Éthanol absolu (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Co.KG ; | A3678,0250 ; | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH ; | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-souris HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-lapin HRP | Thermo Fisher ; Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Lumi-Light Western Blot Substrat | Sigma-Aldrich Chemie GmbH ; | ||
| de culture cellulaire à 96 puits | Greiner Bio-One GmbH ; | 655 180 ; | |
| Seringue Terumo 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 mL, 0,45 & micro ; m ; | SARSTEDT ; | 83.1823.100 ; | |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolution | gel Bio-Rad Laboratoris GmbH ; | 456-9034 ; | |
| Plaque de culture cellulaire à 6 puits | Greiner Bio-One GmbH ; | 657160 ; | |
| Plats Nunclon 150/20 ; | Fisher Scientific GmbH ; | 10098720 - 168381 | |
| Racleur cellulaire | neoLab Migge GmbH ; | C-8120 ; | |
| Tube, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH ; | 227261 ; | |
| Tube SafeSeal sans RNase ; | SARSTEDT ; | 72.706.400 ; | |
| Tubes à centrifuger ultra clairs 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH ; | 344062 | |
| Aiguilles d’aspiration | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. Astuce 1000 ; | SARSTEDT ; | 70.762.211 ; | |
| Biosphère Fil. Astuce 200 | SARSTEDT ; | 70.760.211 ; | |
| Biosphère Fil. Astuce 10 | SARSTEDT ; | 70.1130.210 ; | |
| Broyeur de mouchoirs Fisher | Scientific GmbH ; | ||
| pilons pour broyeurs de tissus tout en verre Dounce | Fisher Scientific GmbH ; | ||
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer confort, avec Thermoblock 1,5 mL | Eppendorf | 5355 ; 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, module Mini Trans-Blot et bloc d’alimentation de base PowerPac, ; | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Chambre de coulée multiple | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Alimentation | Biorad | 164-5052 | |
| Centrifugeuse ; | Eppendorf | 5424R | |
| ; | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH ; | 365670 | |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH ; | ||
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
Références
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L.
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Réimpressions et autorisations
