Summary

Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari<em> In vitro</em

Published: July 05, 2017
doi:

Summary

Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).

Abstract

Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.

Introduction

I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che non sono molto colorate, come le cipolle e l'aglio, provenienti dalla famiglia di scalloni e sono associati a numerosi benefici per la salute 4 . Oltre ad essere associati a numerosi vantaggi sanitari 5 , i polifenoli servono anche le piante proteggendole dagli insettiD radiazione ultravioletta 2 . I polifenoli si trovano comunemente nella dieta umana e sono considerati potenti antiossidanti, in quanto possono scavare le specie reattive di ossigeno (ROS) 6 , 7 , 8 . Hanno anche antinfiammatori 9 , antimicrobici 10 , antipertensivi 11 e 12 , 13 proprietà anti-cancerogene.

Gli studi epidemiologici dimostrano un'associazione inversa tra il consumo di flavonoidi e la malattia cardiovascolare (CVD) 16 , 17 e la mortalità 14 , 15 . Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno elevate quantità di polifenoli, compresi i flavonoidi. Ad esempio, il consumo di succo di mora (BL) (300 Ml / d) per otto settimane ha significativamente ridotto la pressione sistolica nei pazienti dislipidemici 18 . Jeong et al. 19 riportarono che gli uomini e le donne pre-ipertensivi che consumavano 2,5 g di estratto di lampone nero (BRB) al giorno avevano una pressione arteriosa più bassa di 24 ore e di notte rispetto a quelle che consumavano un placebo. Raspberries (RB) ha ridotto la pressione sanguigna mentre aumenta l'espressione di superossido dismutasi (SOD) in ratti spontaneamente ipertensivi 20 . Recentemente è stato dimostrato che BL, RB e BRB riducono i livelli di ROS e senescenza indotti da angiotensina II (Ang II) in cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) 21 . Inoltre, la frazione di antocianina dall'estratto BL ha ridotto l'espressione di sintesi dell'ossido nitrico induttivo (iNOS) e ha inibito l'attività del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e della chinasi extracellulare-regolata (ERK) nel lipopolisaccaride (LPS) stimolata J774 celluleAss = "xref"> 22. Gli estratti BRB hanno ridotto l'attivazione di NF-κB e l'espressione cicloossigenasi 2 (COX-2) in vitro 23 , ha migliorato il profilo lipidico e ha impedito la formazione di lesioni aterosclerosi nei topi alimentati ad una dieta ad alto contenuto di grassi 24 . Le antocianine, considerate i flavonoidi più abbondanti nelle bacche, modulano la risposta infiammatoria nei macrofagi RAW 264.7 stimolati da LPS diminuendo la produzione di alfa TNF-α 25 e diminuendo la proliferazione e la migrazione di VSMCs 26 .

Dal momento che è cresciuto interesse a capire il ruolo dei polifenoli nella salute umana e nelle malattie, è importante ottimizzare il metodo di estrazione. L'estrazione del solvente è ampiamente utilizzata per questo scopo, in quanto è conveniente e facilmente riproducibile. In questo studio, è stata utilizzata un'estrazione di solvente con l'etanolo, insieme ad un estratto ad ultrasuoniN, che è stato adattato da Kim e Lee 27 . La purificazione e la frazionamento di estratti grezzi (CE) utilizzando cloroformio e acetato di etile sono state eseguite per ottenere la frazione di estratto purificato (PE) che è stato adattato da Queires et al 28 . Inoltre, sono stati confrontati l'efficacia degli estratti di polifenoli grezzi e purificati da BL alla riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2 e sono stati forniti esempi rappresentativi dell'effetto inibitorio dell'estratto policifenolo BL purificato sulle riduzioni di segnalazione induciate da Ang II in VSMCs.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti Preparare l'etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare. Per preparare l'estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C. Preparare il buffer di lisi. Aggiung…

Representative Results

È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II 21 . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l'espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidi…

Discussion

I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia,…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).

Materials

Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
DMEM Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
FBS Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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Citer Cet Article
Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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