גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה
Summary
עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.
Abstract
פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא מצב רפואי נפוץ עם שיעור תמותה גבוה. עם יכולות התיקון של הכליה, ניתן לשחזר תפקוד כליות נאות לאחר טיפול תומך. עם זאת, הבנה טובה יותר של איך המוות נפרון התא והתיקון מתרחשים ברמה התאית נדרש כדי למזער את המוות התא כדי לשפר את תהליך התחדשות. דג הזברה pronephros היא מערכת מודל טוב כדי להשיג מטרה זו משום שהיא מכילה קטעים אנטומיים הדומים נפרון יונקים. בעבר, המודל הנפוץ ביותר המשמש לחקר פגיעה בכליות בדגים היה מודל גנטמיצין פרמקולוגי. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר שליטה מדויקת spatiotemporal של פגיעה, ולכן קשה ללמוד תהליכים תאיים ומולקולריים המעורבים תיקון כליות. כדי להתגבר על מגבלה זו, עבודה זו מציגה שיטה שבאמצעותה, בניגוד לגישה של ג'נטמיצין, חלבונים מסוימים של פרוטאינים ירוקים (GFP)לחיצה על קטע נפרון יכול להיות photablated באמצעות אור לייזר סגול (405 ננומטר). זה מודל חדשני של AKI מספק יתרונות רבים כי שיטות אחרות של פציעה אפיתל חסר. היתרונות העיקריים שלו הם היכולת "לחייג" את רמת הפציעה ואת השליטה המדויקת spatiotemporal חזקים מודל חיות vivo . שיטה חדשה זו יש פוטנציאל לקדם באופן משמעותי את רמת ההבנה של פגיעה בכליות מנגנוני תיקון.
Introduction
פגיעה חריפה בכליות (AKI) , 1 , 2 , אשר גם יכול להיקרא אי ספיקת כליות חריפה, מוגדר באופן כללי כמו ליקוי פתאומי בתפקוד הכליות 3 . בעוד שרמת ההבנה של מצב זה שופרה במידה ניכרת לאורך השנים, שיעורי התחלואה והתמותה נותרו גבוהים , 1 , 2 . הטיפול הנוכחי במצב זה הוא בעיקר תומך, כמו תוצאות של ניסויים קליניים מרובים של טיפול תרופתי כבר שלילי 4 , 5 . הכליה היא ייחודית בכך שיש לה את היכולת לתקן את עצמה. לכן, טיפול תומך לאחר אבחון מוקדם של AKI הוא הדרך הטובה ביותר להגביל את התחלואה 6 . עם זאת, קשה לזהות AKI מוקדם, ושיעור התמותה הוא מדהים 50-80% עבור אלה הזקוקים לדיאליזה 5. עם היכולת של הכליות לתקן את עצמם ואת חוסר אפשרויות הטיפול עבור מצב זה, חשוב לפתח שיטות כדי לשפר את תהליך התחדשות נפרון.
היו הרבה מודלים שונים המשמשים במחקר AKI הכולל סוכנים שונים של פגיעה ומודלים של בעלי חיים. במונחים של סוכנים של נזק לכליות, aminoglycoside גנטמיצין אנטיביוטי שימש כסוכן nephrotoxic שמוביל AKI 7 , 8 . עם זאת, מספר קבוצות מצאו כי טיפול גנטמיצין הוא קטלני העובר דג הזברה 9 . זה גורם נזק צינורי כי הוא רציני מדי עבור התאוששות העובר, מה שהופך את המחקר של התחדשות קשה ללא סוג כלשהו של התערבות. מודלים יונקים, כמו העכבר חולדה, נחשבים גם בעלי ערך, אבל הם עומדים בפני מגבלות רבות במהלך המחקר של AKI. אולי החיסרון העיקרי של מודלים מכרסמים הוא הקושי visuaLizing את הכליה מכרסם ובכך לקבוע את התהליכים spatiotemporal מדויק המוביל מוות ותיקון אפיתל.
Johnson et al. דיווחו לייזר לייזר טכניקה מבוססת כדי לגרום פגיעה בכליות חריפה של דג הזברה עובריים 9 הזחל. הם השתמשו אבלציה לייזר פעמו לפגוע בכליה לאחר הזרקת שריר עם הצמד דקסטרן. הקרינה מן מצמידים dextran מאפשר הדמיה של נזק התחדשות אפיתל 9 אבובית. מודל זה מתגבר על שתי המגבלות שהוזכרו לעיל, אך הוא אינו מאפשר רמות מוגדרות של פגיעה וקשה לבצע על קבוצות תאים שרירותיות גדולות.
החדש לייזר אבלציה מבוסס מודל דג הזברה של AKI המתואר כאן כתובות כל המגבלות לעיל. הכליה pronephric בזברה דג הזחל הוא איבר מבוגר, מתפקד המכיל קטעים דומים יונקים nePhron, כולל גלומרולוס, tubules פרוקסימלי ודיסטלי, וכן צינור איסוף 10 . הזחלים דג הזברה הם גם שקופים אופטית, מה שהופך אותו ריאלי לצפות בכליות באמצעות טכניקות הקרינה. לכן, דג הזברה הם בעלי ערך במודל vivo של AKI, ואת הכליה pronephric הזחל (5-12 ימים לאחר הפריה (dpf)) ניתן להשתמש כדי ללמוד את התהליכים הסלולר המולקולרי מעורב פגיעה בכליות ותיקון.
מאמר זה מציג שיטה שבאמצעותה חלבונים ספציפיים של חלבונים ירוקים (GFP) של נפרון יכולים להיות מצולמים באמצעות מערכת אנרגיית אור נמוכה (בהשוואה למערכת לייזר פולס), אור לייזר סגול (405 ננומטר). הקרינה GFP מאפשר מיקוד של קבוצה של תאים, מה שהופך את השינויים המתרחשים גלוי דרך תצפית של photobleaching GFP. בנוסף, GFP (על ידי קליטת אור סגול) משמש כיור אנרגיה כדי potentiate הפציעה GFP- להביע תאים כליות. זמן לשגות microsעותק ואז ניתן להשתמש כדי ללמוד את תהליך התיקון. מחקרים מצאו התפשטות תאים, הגירה תא, metaplasia התא 11 , 12 , 13 להיות כל התהליכים הפוטנציאליים שעשויים לשחק תפקיד חשוב לתיקון הכליות. עם זאת, את החשיבות היחסית של תהליכים אלה ואת הפרטים של גומלין שלהם היה קשה לחשוף בשל מגבלות של מודלים קיימים של AKI. באמצעות גישה חדשה זו, ניתן היה להראות כי הגירה תא ממלא תפקיד מרכזי לתיקון כליות לאחר פגיעה חריפה 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לציין כי כוח הלייזר הכולל משתנה בין מערכות. עם זאת, באמצעות אחוזים gob photobleaching מאפשר readout של האנרגיה הכוללת נמסר כליה ניאון, עצמאית של וריאציה לייזר כוח פיצוי על ידי אורך החשיפה. יש לזכור, עם זאת, כי התגובה של רקמות שונות בשיטה זו של photoablation משתנה. גם במהלך התבגרות הכלי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ד"ר איין Drummond וד"ר ולדימיר Korzh לשיתוף כליה GFP כליה מהונדס. כמו כן, ברצוננו להודות ל- NYITCOM על אספקת המשאבים הדרושים לביצוע עבודה זו. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), ומענק פיילוט HSCI (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
