Precise Cellular Ablation Approach voor het modelleren van acute nierbeschadiging bij het ontwikkelen van zebravis
Summary
Dit werk presenteert een nieuw in vivo model van segmentale nierbeschadiging met behulp van transplantale zebravis van GFP van de nieren. Het model zorgt voor de inductie van de gerichte ablatie van nierepitheelcellen om de cellulaire mechanismen van nephron letsel en reparatie te tonen.
Abstract
Acute nierbeschadiging (AKI) is een algemene medische aandoening met een hoge sterftecijfer. Met de herstelmogelijkheden van de nier, is het mogelijk om een adequate nierfunctie te herstellen na ondersteunende behandeling. Echter, een beter begrip van hoe nefroncel dood en reparatie op het cellulaire niveau optreden is nodig om de cel dood te minimaliseren en het regeneratieve proces te verbeteren. De zebravis pronephros is een goed model systeem om dit doel te bereiken omdat het anatomische segmenten bevat die vergelijkbaar zijn met de zoogdiernefron. Voorheen was het meest voorkomende model dat nierbeschadiging bij vis bestudeerde, het farmacologische gentamicine model. Dit model staat echter niet toe voor een nauwkeurige spatiotemporale controle op letsel, en daarom is het moeilijk om cel- en moleculaire processen die betrokken zijn bij nierherstel, te bestuderen. Om deze beperking te overwinnen, presenteert dit werk een methode waarbij, in tegenstelling tot de gentamicine-aanpak, een specifiek Groene Fuorescerende Proteïne (GFP) -exexHet drukken van nefronen kan worden gefotografeerd met behulp van een violet laserlicht (405 nm). Dit nieuwe model van AKI biedt vele voordelen die andere methoden van epitheliaal letsel ontbreken. De voornaamste voordelen hiervan zijn de mogelijkheid om het niveau van letsel te "dialeren" en de precieze spatiotemporale controle in het robuuste in vivo diermodel. Deze nieuwe methode heeft het potentieel om het niveau van begrip van nierbeschadiging en herstelmechanismen aanzienlijk te bevorderen.
Introduction
Acute nierbeschadiging (AKI) 1 , 2 , die ook kan worden aangeduid als acuut nierfalen, wordt algemeen gedefinieerd als een plotselinge aandoening bij nierfunctie 3 . Hoewel het niveau van begrip van deze aandoening in de loop der jaren opvallend verbeterd is, zijn de morbiditeit en sterftecijfers hoog 1 , 2 gebleven. De huidige behandeling voor deze aandoening is meestal ondersteunend, aangezien de resultaten van meerdere klinische proeven van geneesmiddelentherapie negatief zijn geweest, 4 , 5 . De nier is uniek omdat het het vermogen heeft zich te herstellen. Daarom is ondersteunende therapie na een vroege diagnose van AKI de beste manier om morbiditeit 6 te beperken. Het is echter moeilijk om vroegtijdig AKI te detecteren en de sterftecijfer is een vervelende 50-80% voor degenen die dialyse 5 nodig hebben. Met het vermogen van de nieren om zichzelf te repareren en het gebrek aan behandelingsopties voor deze conditie, is het belangrijk om methoden te ontwikkelen om dit nefronregeneratieproces te verbeteren.
Er zijn veel verschillende modellen gebruikt voor AKI onderzoek dat verschillende agenten van letsel en diermodellen omvat. Wat betreft agens van nierschade is het aminoglycoside antibiotica gentamicine gebruikt als een nefrotoxisch middel dat leidt tot AKI 7 , 8 . Echter, verschillende groepen hebben gevonden dat gentamicin behandeling dodelijk is voor het zebravis embryo 9 . Het veroorzaakt tubulaire schade die te ernstig is voor embryoherstel, waardoor de studie van regeneratie moeilijk is zonder enige vorm van interventie. Zoogdierenmodellen, zoals de muis en de ratten, worden ook als waardevol beschouwd, maar ze worden geconfronteerd met vele beperkingen tijdens de studie van AKI. Misschien is het grootste nadeel van knaagdiermodellen het probleem in visuaHet nieren van de knaagdier lanceren en daarmee de precieze spatiotemporale processen bepalen die leiden tot epitheliale dood en reparatie.
Johnson et al. Hebben een laser ablation-gebaseerde techniek aangemeld om acuut nierbeschadiging in embryonale en larvezebravis 9 te veroorzaken. Ze gebruikten pulsed laser ablation om de nier te beschadigen na een intramusculaire injectie met dextran conjugaten. De fluorescentie van dextranconjugaten zorgt voor het visualiseren van schade en regeneratie in het buisepitheel 9 . Dit model overwint de bovengenoemde twee beperkingen, maar staat niet toe voor gegradeerde niveaus van letsel en kan moeilijk worden uitgevoerd op grote, willekeurige celgroepen.
Het nieuwe laserablation-gebaseerde zebravismodel van AKI dat hier beschreven is, adresseert alle bovengenoemde beperkingen. De pronephrische nier in de zebravis van larve is een volwassen, functioneel orgaan dat segmenten bevat die vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nePhron, inclusief een glomerulus, proximale en distale buisjes, en een verzamelkanaal 10 . Zebravis larven zijn ook optisch transparant, waardoor het mogelijk is om de nier te waarnemen door middel van fluorescentietechnieken. Zebravis zijn dus een waardevol in vivo model van AKI, en de larve pronephrische nier (5-12 dagen post-fertilisatie (dpf)) kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij nierletsel en reparatie te bestuderen.
In dit artikel wordt een methode beschreven, waarbij specifieke Nefron-segmenten van het Groene Fluorescerende Proteïne (GFP) -expressie kunnen worden gefabriceerd met behulp van een licht-energie (in vergelijking met een pulserend laser systeem) violet laserlicht (405 nm). De GFP-fluorescentie zorgt voor de targeting van een groep cellen, waardoor de veranderingen die optreden zichtbaar zijn door de waarneming van GFP photobleaching. Daarnaast dient GFP (door het absorberen van violet licht) als een energiezink om het letsel in GFP-expressieve niercellen te versterken. Time-lapse microsKopie kan dan gebruikt worden om het reparatieproces te bestuderen. Studies hebben cel proliferatie, celmigratie en celmetaplasia 11 , 12 , 13 gevonden voor alle mogelijke processen die een belangrijke rol kunnen spelen bij nierherstel. Het relatieve belang van deze processen en de details van hun wisselwerking is echter moeilijk te ontdekken door de beperkingen van bestaande modellen van AKI. Met behulp van deze nieuwe aanpak was het mogelijk om te laten aantonen dat celmigratie een centrale rol speelt bij nierherstel na acuut letsel 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Opgemerkt moet worden dat de totale laservermogen varieert tussen systemen. Door gebruik te maken van procent GFP fotobleaching kan echter een uitlezing van de totale energie afgegeven aan de fluorescerende nier, onafhankelijk van de variatie in laservermogen en gecompenseerd worden door de lengte van de blootstelling. Houd er rekening mee dat de reactie van verschillende weefsels op deze methode van fotoablation varieert. Zelfs tijdens de rijping van de nieren is het aanzienlijk moeilijker om een GFP-fluorescenti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Iain Drummond en Dr. Vladimir Korzh voor het delen van transgene GFP-transacties. We willen ook NYITCOM bedanken voor het verstrekken van benodigde middelen om dit werk uit te voeren. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) en de HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
