Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch
Summary
Diese Arbeit präsentiert ein neues in vivo Modell der segmentalen Nierenverletzung mit Nieren GFP transgenen Zebrafisch. Das Modell ermöglicht die Induktion der gezielten Ablation von Nierenepithelzellen, um die zellulären Mechanismen der Nephronverletzung und Reparatur zu zeigen.
Abstract
Akute Nierenverletzung (AKI) ist eine häufige Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Mit den Reparaturfähigkeiten der Niere ist es möglich, eine adäquate Nierenfunktion nach einer unterstützenden Behandlung wiederherzustellen. Jedoch ist ein besseres Verständnis davon, wie Nephron-Zelltod und -reparatur auf zellulärer Ebene stattfinden, erforderlich, um den Zelltod zu minimieren und den regenerativen Prozess zu verbessern. Der Zebrafisch pronephros ist ein gutes Modellsystem, um dieses Ziel zu erreichen, weil es anatomische Segmente enthält, die dem Säugetier-Nephron ähnlich sind. Bisher war das häufigste Modell, das verwendet wurde, um Nierenverletzungen bei Fischen zu untersuchen, das pharmakologische Gentamicin-Modell. Allerdings erlaubt dieses Modell keine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle der Verletzung, und daher ist es schwierig, zelluläre und molekulare Prozesse zu untersuchen, die an der Nierenreparatur beteiligt sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, stellt diese Arbeit eine Methode dar, durch die im Gegensatz zum Gentamicin-Ansatz ein spezifisches Green Fuorescent Protein (GFP) -exPress-Nephron-Segment kann mit einem violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden. Dieses neuartige Modell von AKI bietet viele Vorteile, die andere Methoden der Epithelverletzung fehlen. Seine Hauptvorteile sind die Fähigkeit, das Verletzungsniveau und die präzise räumlich-zeitliche Kontrolle im robusten In-vivo- Tiermodell zu "wählen". Diese neue Methode hat das Potenzial, das Niveau des Verständnisses von Nierenverletzungen und Reparaturmechanismen deutlich zu verbessern.
Introduction
Akute Nierenverletzung (AKI) 1 , 2 , die auch als akutes Nierenversagen bezeichnet werden kann, ist weitgehend als plötzliche Beeinträchtigung der Nierenfunktion definiert 3 . Während das Niveau des Verständnisses dieser Bedingung im Laufe der Jahre bemerkenswert verbessert wurde, blieben die Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten hoch 1 , 2 . Die derzeitige Behandlung für diese Bedingung ist meist unterstützend, da die Ergebnisse aus mehreren klinischen Studien der medikamentösen Therapie negativ waren 4 , 5 . Die Niere ist einzigartig darin, dass sie die Fähigkeit hat, sich selbst zu reparieren. Daher ist die unterstützende Therapie nach einer frühen Diagnose von AKI der beste Weg, um die Morbidität zu begrenzen 6 . Allerdings ist es schwierig, AKI frühzeitig zu erkennen, und die Sterblichkeit ist eine Staffelung von 50-80% für diejenigen, die Dialyse benötigen 5. Mit der Fähigkeit der Nieren, sich selbst zu reparieren und die Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für diese Bedingung, ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um diese Nephron-Regeneration zu verbessern.
Es gab viele verschiedene Modelle für AKI-Forschung, die verschiedene Agenten der Verletzung und Tier-Modelle enthält verwendet. In Bezug auf Agenten der Nierenschädigung wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin als nephrotoxisches Mittel verwendet, das zu AKI 7 , 8 führt . Allerdings haben mehrere Gruppen festgestellt, dass Gentamicin Behandlung ist tödlich für die Zebrafisch Embryo 9 . Es verursacht Schlauchschäden, die für die Embryo-Erholung zu ernst sind, was das Studium der Regeneration ohne irgendeine Art von Intervention schwierig macht. Säugetiermodelle, wie die Maus und die Ratte, werden auch als wertvoll angesehen, aber sie stehen vor vielen Einschränkungen während des Studiums von AKI. Vielleicht ist der Hauptnachteil von Nagetiermodellen die Schwierigkeit in VisuaDie Nagetierniere zu verteilen und so die präzisen räumlich-zeitlichen Prozesse zu bestimmen, die zu epithelialem Tod und Reparatur führen.
Johnson et al. Haben eine Laserablations-basierte Technik berichtet, um eine akute Nierenverletzung in embryonalen und larvalen Zebrafisch zu induzieren 9 . Sie verwendeten gepulste Laserablation, um die Niere nach einer intramuskulären Injektion mit Dextran-Konjugaten zu beschädigen. Die Fluoreszenz von Dextran-Konjugaten ermöglicht die Visualisierung von Schädigung und Regeneration im Tubulusepithel 9 . Dieses Modell überwindet die beiden oben erwähnten Einschränkungen, erlaubt aber keine abgestuften Verletzungsstörungen und ist bei großen, willkürlichen Zellgruppen schwer durchführbar.
Das hier beschriebene neue Laserablations-basierte Zebrafisch-Modell von AKI adressiert alle oben genannten Einschränkungen. Die pronephrische Niere im Larven-Zebrafisch ist ein reifes, funktionierendes Organ, das Segmente ähnlich dem Säugetier ne enthältPhron, einschließlich eines Glomerulus, proximalen und distalen Tubuli, und einem Sammelkanal 10 . Zebrafisch-Larven sind auch optisch transparent, so dass es möglich ist, die Niere durch Fluoreszenztechniken zu beobachten. So ist Zebrafisch ein wertvolles In-vivo- Modell von AKI, und die Larven-pronephrische Niere (5-12 Tage nach der Befruchtung (dpf)) kann verwendet werden, um die zellulären und molekularen Prozesse, die an Nierenverletzungen und Reparaturen beteiligt sind, zu untersuchen.
Dieses Papier stellt eine Methode dar, durch die spezifische Green Fluorescent Protein (GFP) -exprimierende Nephronsegmente unter Verwendung einer Niedrigenergie (im Vergleich zu einem gepulsten Lasersystem) violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden können. Die GFP-Fluoreszenz ermöglicht das Targeting einer Gruppe von Zellen, wodurch die Veränderungen entstehen, die durch die Beobachtung von GFP-Photobleichen sichtbar werden. Darüber hinaus dient GFP (durch Absorption von violettem Licht) als Energiesenke, um die Verletzung in GFP-exprimierenden Nierenzellen zu verstärken. Zeitraffer-MikrosKopie kann dann verwendet werden, um den Reparaturprozess zu studieren. Studien haben Zellproliferation, Zellmigration und Zellmetaplasie 11 , 12 , 13 gefunden, um alle mögliche Prozesse, die eine wichtige Rolle bei der Nierenreparatur spielen können. Allerdings ist die relative Bedeutung dieser Prozesse und die Details ihres Zusammenspiels aufgrund der Einschränkungen bestehender AKI-Modelle schwer aufzudecken. Mit diesem neuartigen Ansatz konnte gezeigt werden, dass die Zellmigration eine zentrale Rolle bei der Nierenreparatur nach akuten Verletzungen spielt. 14
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist zu beachten, dass die gesamte Laserleistung zwischen den Systemen variiert. Jedoch ermöglicht die Verwendung von Prozent-GFP-Photobleichen ein Auslesen der Gesamtenergie, die an die fluoreszierende Niere abgegeben wird, unabhängig von der Änderung der Laserleistung und kompensiert durch die Belichtungsdauer. Denken Sie jedoch daran, dass die Reaktion der verschiedenen Gewebe auf diese Methode der Photoablation variiert. Auch bei der Nierenreifung ist es wesentlich schwieriger, eine 50% ige Reduktion der GFP-Fl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Iain Drummond und Dr. Vladimir Korzh für den Austausch von Nieren-GFP-transgenen Linien. Wir danken auch NYITCOM für die Bereitstellung notwendiger Ressourcen für diese Arbeit. Diese Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) und der HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
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