Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Summary

Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.

Abstract

La lesión aguda del riñón (LRA) es una condición médica común con una alta tasa de mortalidad. Con las habilidades de reparación del riñón, es posible restaurar la función renal adecuada después del tratamiento de apoyo. Sin embargo, se necesita una mejor comprensión de cómo la muerte y la reparación de las células nefronas ocurren a nivel celular para minimizar la muerte celular y mejorar el proceso regenerativo. El pronefros del pez cebra es un buen sistema modelo para lograr este objetivo porque contiene segmentos anatómicos que son similares al nefrón de mamíferos. Anteriormente, el modelo más común utilizado para estudiar la lesión renal en los peces era el modelo farmacológico de la gentamicina. Sin embargo, este modelo no permite un control espaciotemporal preciso de la lesión, por lo que es difícil estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la reparación renal. Para superar esta limitación, este trabajo presenta un método a través del cual, en contraste con el enfoque de gentamicina, una proteína verde fluorescente específica (GFP) -exEl prensado del segmento nefrón puede ser fotoablado usando una luz láser violeta (405 nm). Este nuevo modelo de AKI proporciona muchas ventajas que otros métodos de lesión epitelial carecen. Sus principales ventajas son la capacidad de "marcar" el nivel de lesión y el control espaciotemporal preciso en el robusto modelo animal in vivo . Este nuevo método tiene el potencial de avanzar significativamente el nivel de comprensión de la lesión renal y los mecanismos de reparación.

Introduction

La lesión aguda del riñón ^{1 , 2} , que también se puede denominar insuficiencia renal aguda, se define ampliamente como una alteración súbita de la función renal ³ . Mientras que el nivel de comprensión de esta condición se ha mejorado notablemente en los últimos años, las tasas de morbilidad y mortalidad se han mantenido altas ^{1 , 2} . El tratamiento actual para esta condición es en su mayoría de apoyo, ya que los resultados de múltiples ensayos clínicos de la terapia de drogas han sido negativos ^{4 , 5} . El riñón es único en que tiene la capacidad de repararse. Por lo tanto, la terapia de apoyo después de un diagnóstico precoz de la IRA es la mejor manera de limitar la morbilidad ⁶ . Sin embargo, es difícil detectar la LRA tempranamente, y la tasa de mortalidad es sorprendente en un 50-80% para aquellos que requieren diálisis ⁵. Con la capacidad de los riñones para repararse y la falta de opciones de tratamiento para esta condición, es importante desarrollar métodos para mejorar este proceso de regeneración de nefrón.

Ha habido muchos modelos diferentes utilizados para la investigación de AKI que incluye diferentes agentes de lesiones y modelos animales. En términos de agentes de daño renal, el aminoglucósido antibiótico gentamicina se ha utilizado como un agente nefrotóxico que conduce a AKI ^{7 , 8} . Sin embargo, varios grupos han encontrado que el tratamiento con gentamicina es letal para el embrión de pez cebra ⁹ . Provoca daños tubulares que son demasiado graves para la recuperación del embrión, haciendo difícil el estudio de la regeneración sin algún tipo de intervención. Los modelos de mamíferos, como el ratón y la rata, también se consideran valiosos, pero se enfrentan a muchas limitaciones durante el estudio de la LRA. Tal vez la principal desventaja de los modelos de roedores es la dificultad en visuaDeterminando así los procesos espaciotemporales precisos que conducen a la muerte y reparación epiteliales.

Johnson et al. Han informado de una técnica basada en la ablación con láser para inducir una lesión renal aguda en el pez cebra embrionario y larval ⁹ . Utilizaron la ablación láser pulsada para dañar el riñón después de una inyección intramuscular con conjugados de dextrano. La fluorescencia de los conjugados dextrano permite la visualización del daño y la regeneración en el epitelio de los túbulos [ ^9] . Este modelo supera las dos limitaciones mencionadas anteriormente, pero no permite niveles graduados de lesión y es difícil de llevar a cabo en grandes grupos de células arbitrarias.

El nuevo modelo basado en la ablación láser de pez cebra de AKI descrito aquí se ocupa de todas las limitaciones anteriores. El riñón proneférico en el pez cebra larvario es un órgano maduro y funcional que contiene segmentos similares a los mamíferos nePhron, incluyendo un glomérulo, túbulos proximal y distal, y un conducto colector ¹⁰ . Las larvas de pez cebra también son ópticamente transparentes, lo que hace factible observar el riñón a través de técnicas de fluorescencia. Por lo tanto, el pez cebra es un valioso modelo in vivo de IRA, y el riñón pronefrico larvario (5-12 días después de la fecundación (dpf)) puede ser usado para estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la lesión renal y la reparación.

Este artículo presenta un método a través del cual los segmentos de nefrona que expresan la Proteína Fluorescente Verde (GFP) específica pueden ser fotoablados usando una luz láser violeta de baja energía (en comparación con un sistema de láser pulsado) (405 nm). La fluorescencia GFP permite la orientación de un grupo de células, haciendo que los cambios que se hacen visibles a través de la observación de GFP photobleaching. Además, la GFP (mediante la absorción de luz violeta) sirve como un sumidero de energía para potenciar la lesión en células renales que expresan GFP. Micros de lapso de tiempoCopia se puede utilizar para estudiar el proceso de reparación. Los estudios han encontrado que la proliferación celular, la migración celular y la metaplasia celular ^{11 , 12 , 13} son procesos potenciales que pueden desempeñar un papel importante en la reparación renal. Sin embargo, la importancia relativa de estos procesos y los detalles de su interacción han sido difíciles de descubrir debido a las limitaciones de los modelos existentes de AKI. Utilizando este nuevo enfoque, fue posible demostrar que la migración celular desempeña un papel central en la reparación renal después de una lesión aguda [ ^14] .

Protocol

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Colegio de Medicina de Osteopatía de NYIT Instituto de Cuidado de Animales y Comité de Uso (NYITCOM IACUC). Toda la cirugía y la experimentación in vivo se realizó bajo anestesia con tricaína, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. 1. Obtención y manteni…

Representative Results

Tenga en cuenta que este protocolo se utilizó con éxito con un número de líneas transgénicas GFP renal, incluyendo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 y Tg (atp1a1a.4: GFP). Los resultados de ejemplo mostrados aquí se obtuvieron usando la línea sqet11-9 de ET (krt8: EGFP). La Figura 1 muestra el ejemplo del protocolo de fotoabla- ción. La intensidad media de GFP se monitor…

Discussion

Cabe señalar que la potencia total del láser varía entre sistemas. Sin embargo, el porcentaje de fotoblanqueo GFP permite una lectura de la energía total entregada al riñón fluorescente, independientemente de la variación en la potencia láser y compensada por la duración de la exposición. Tenga en cuenta, sin embargo, que la respuesta de los diferentes tejidos a este método de fotoablación varía. Incluso durante la maduración del riñón, es significativamente más difícil obtener una reducción del 50% e…

Materials

Petri Dishes, 35 x 10mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4,2.7
Petri Dishes, 100 x 15mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2