Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes
Summary
Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.
Abstract
microtúbulos dinámicos son fundamentales para muchos procesos celulares, y las mediciones precisas de la dinámica de microtúbulos pueden dar una idea de cómo las células regulan estos procesos y cómo las mutaciones genéticas regulación impacto. La cuantificación de la dinámica de los microtúbulos en los modelos de metazoos tiene una serie de desafíos asociados, incluyendo una alta densidad de microtúbulos y limitaciones a las manipulaciones genéticas. Por el contrario, el modelo de levadura en ciernes ofrece ventajas que superan estos desafíos. Este protocolo describe un método para medir la dinámica de los microtúbulos individuales en células de levadura viva. Las células que expresan tubulina marcado con fluorescencia se adhieren a las cámaras de diapositivas ensambladas, lo que permite la adquisición de imágenes de lapso de tiempo estable. Una guía detallada para la alta velocidad, también se proporciona la adquisición de imágenes de cuatro dimensiones, así como un protocolo para la cuantificación de las propiedades de los microtúbulos dinámicos en pilas de imágenes confocal. Este método, combinado con la genética de levadura convencionales, provIdeS un enfoque que es especialmente adecuado para evaluar cuantitativamente los efectos de los reguladores de microtúbulos o mutaciones que alteran la actividad de subunidades de tubulina.
Introduction
Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto hechas de subunidades de la proteína delta gamma-tubulina y se utilizan en una amplia variedad de contextos celulares, incluido el transporte intracelular, la división celular, la morfogénesis y la motilidad. Para construir redes de microtúbulos para estas diversas funciones, las células deben regular cuidadosamente dónde y cuándo se forma microtúbulos. Esta regulación se lleva a cabo mediante el control de las reacciones que, o bien montar subunidades delta gamma-tubulina en microtúbulos polímeros o microtúbulos desmonte en subunidades libres; esto se conoce como dinámica de los microtúbulos.
Un objetivo importante del campo de microtúbulos es dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la dinámica de los microtúbulos, incluyendo estudios de las subunidades delta gamma-tubulina y reguladores extrínsecos que se unen a la tubulina y / o a los microtúbulos. Un enfoque experimental bien establecido es para reconstituir este sistema in vitro usando proteína αβ-tubulina purificada, a menudo en comcombinación con los reguladores extrínsecos purificados. Aunque este es un enfoque útil, está claro que la dinámica de los microtúbulos en los sistemas reconstituida difiere considerablemente de la observada en las células vivas. Por ejemplo, los microtúbulos crecen más rápido y más lento se reducen in vivo que in vitro. Estas diferencias pueden ser atribuidas a la disponibilidad de reguladores extrínsecos conocidos 1, así como a factores aún no definido en las células. Por lo tanto, es fundamental para determinar las actividades de los reguladores de microtúbulos y mutantes que perturban la dinámica en un contexto celular nativo.
Aunque los modelos de metazoos han demostrado ser los sistemas existentes para la investigación de función de los microtúbulos y la organización de orden superior, varias preocupaciones prácticas limitan severamente la utilidad de estos modelos para la medición precisa de la dinámica de los microtúbulos. En primer lugar, el elevado número de microtúbulos, que van desde decenas a miles por célula, hace que sea difícil de confianzarealizar un seguimiento de los microtúbulos individuales a través del tiempo. Muchos estudios abordan este reto por imágenes proteínas que se localizan selectivamente a los extremos de los microtúbulos, tales como proteínas en la familia de unión final (EB). Sin embargo, se sabe que estas proteínas para localizar sólo a los extremos de creciente microtúbulos en metazoos 2. Por lo tanto, la utilidad de estas proteínas está limitada a la medición directa de las tasas de crecimiento, mientras que sólo medir indirectamente otros aspectos de la dinámica, como la frecuencia de catástrofe. En segundo lugar, a pesar de los avances en la tecnología de edición genoma, la creación de células que expresan de forma estable la tubulina marcada con fluorescencia o la introducción de mutaciones para manipular selectivamente de tubulina o microtúbulos reguladores sigue siendo un desafío significativo. Por otra parte, la presencia de numerosos isotipos de tubulina en metazoos confunde el estudio de cómo las mutaciones afectan a los genes de tubulina individuales.
El sistema de levadura en ciernes ofrece varias ventajas importantes para la medición en vivo microtubuLe dinámica. La levadura tiene una red de microtúbulos simplificada que permite la visualización de los microtúbulos individuales. En la levadura, los microtúbulos emanan de la organización de los centros conocidos como cuerpos de barra de husillo (SPBs), que están incrustados en la envoltura nuclear 3. Los SPBs sirven como andamios para gamma-tubulina pequeños complejos que nuclean microtúbulos 4, 5. SPBs nuclean dos clases de microtúbulos, los microtúbulos del huso y los microtúbulos astrales. Proyecto microtúbulos del huso en la nucleoplasma y son importantes para la fijación a los cromosomas a través de los microtúbulos del cinetocoro y para estabilizar el husillo a través de la superposición de los microtúbulos interpolares 6. En contraste, el proyecto de microtúbulos astrales hacia el exterior en el citosol y son relativamente raras en comparación con la densa red de microtúbulos del huso. Durante la mitosis, las células pre-anafase tienen sólo 1-2 microtúbulos astrales que emanan de o bien SPB; estos existen como imicrotúbulos ndividual en lugar de como haces 7. El papel de los microtúbulos astrales durante la mitosis es mover el núcleo y eje en la unión entre los compartimentos de la madre y el brote, conocidos como la yema del cuello. Este movimiento implica vías bien definidas que generan fuerza sobre los microtúbulos astrales, tirando el núcleo y husillo hacia y, finalmente, en la yema del cuello 8.
Otra ventaja del sistema de levadura es la utilidad de su genética, que pueden ser utilizados para investigar los reguladores de microtúbulos y subunidades de tubulina con una precisión sin precedentes. La levadura también poseen un repertorio simplificado de isotipos de tubulina: a β-tubulina único gen (tub2) y dos genes alfa-tubulina (TUB1 y tub3). Las mutaciones se pueden introducir fácilmente en estos genes y de ese modo estudiaron en una población de tubulina homogénea 9, 10. Hay una serie de ampliamenteconstrucciones disponibles para los microtúbulos de etiquetado, y estos pueden ser objeto de integración en loci cromosómicos para la expresión estable (véase la discusión).
El objetivo general de este método es a imagen microtúbulos individuales en células de levadura que viven en cuatro dimensiones (X, Y, Z, y t) para mediciones de alta resolución de la dinámica de microtúbulos. Se describen métodos para la integración de construcciones para la expresión constitutiva de bajo nivel de tubulina marcada con fluorescencia en células de levadura. Antes de la formación de imágenes, las células vivas están montados en cámaras de diapositivas revestidas con la lectina Concanavalina A para estabilizar las células para formación de imágenes a largo plazo. Los parámetros óptimos para la adquisición de imágenes, así como un flujo de trabajo para el análisis de datos, también se describen.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de levadura en ciernes ofrece importantes ventajas para la recopilación de mediciones de alta resolución de la dinámica de microtúbulos en un entorno in vivo, incluyendo la capacidad de imagen microtúbulos individuales en el tiempo y la capacidad de manipular tubulins y reguladores de microtúbulos utilizando las herramientas de la genética de la levadura.
Las cámaras recubiertas-A Concanavalina proporcionan un número de ventajas sobre los aparatos descritos anteri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Kerry Bloom (Universidad de Carolina del Norte), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Universidad del Estado de Colorado), y Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) para compartir diversos plásmidos FP-TUB1. Estamos muy agradecidos a Melissa Gardner (Universidad de Minnesota) para nosotros la formación en el método de preparación cámara de diapositivas. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de conceder R01GM112893-01A1 (a JKM) y T32GM008730 (a CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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