Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist
Summary
Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.
Abstract
Dynamische microtubules zijn van fundamenteel belang voor vele cellulaire processen en nauwkeurige metingen van de dynamiek van microtubuli kan inzicht geven in hoe cellen reguleren deze processen en hoe genetische mutaties invloed regelgeving te bieden. De kwantificering van de dynamiek van microtubuli in metazoan modellen heeft een aantal bijbehorende uitdagingen, waaronder een hoge microtubule dichtheid en beperkingen van genetische manipulaties. In contrast, de gist model biedt voordelen die deze uitdagingen te overwinnen. Dit protocol beschrijft een methode om de dynamica van enkelvoudige microtubuli in levende gistcellen te meten. Cellen die fluorescent gelabeld tubuline worden nageleefd geassembleerd dia kamers, waardoor stabiele time-lapse beeldacquisitie. Een uitgebreide gids voor snelle, is het vierdimensionale acquisitie ook verschaft, evenals een protocol voor het kwantificeren van de eigenschappen van de microtubuli in confocale afbeeldingsstapels. Deze werkwijze, in combinatie met gebruikelijke gistgenetica, provIDE benadering die uniek geschikt voor het kwantitatief beoordelen van de effecten van microtubule regulators of mutaties die de activiteit van tubuline subeenheden veranderen.
Introduction
Microtubuli zijn cytoskelet polymeren van αβ-tubuline eiwit subeenheden en worden gebruikt in een grote verscheidenheid aan cellulaire contexten, zoals intracellulair transport, celdeling, morfogenese en motiliteit. Om microtubule netwerken op te bouwen voor deze verschillende rollen, moet cellen zorgvuldig te reguleren waar en wanneer microtubuli vorm. Deze regeling wordt bewerkstelligd door regeling van de reacties die ofwel assembleren αβ-tubuline subeenheden in microtubule polymeren of demonteren microtubules het vrije subeenheden; dit staat bekend als de dynamiek van microtubuli.
Een belangrijk doel van het veld microtubule is om de moleculaire mechanismen die de dynamica van microtubuli, waaronder studies van de αβ-tubuline subeenheden en extrinsieke toezichthouders die zich binden aan tubuline en / of aan microtubuli te reguleren op te helderen. Een gevestigde experimentele benadering om dit systeem te reconstitueren in vitro met gezuiverd tubuline αβ-eiwit, vaak combinatie met gezuiverd extrinsieke regulatoren. Hoewel dit een nuttige aanpak, is het duidelijk dat de dynamiek van microtubuli in gereconstitueerde systemen verschilt sterk van die in levende cellen. Bijvoorbeeld, microtubules sneller groeien en krimpen langzamer in vivo dan in vitro. Dit verschil wordt toegeschreven aan de beschikbaarheid van bekende extrinsieke regulators 1, alsmede een nog-undefined factoren in cellen. Daarom is het van cruciaal belang voor de activiteiten van de microtubule regelgevers en mutanten die dynamiek in een native cellulaire context verstoren bepalen.
Hoewel metazoan modellen hebben bewezen aan de heersende systemen voor het onderzoeken van microtubule functie en hogere orde organisatie, streng een aantal praktische bezwaren het nut van deze modellen te beperken voor de precieze meting van de dynamiek van microtubuli. Ten eerste, het grote aantal microtubuli, variërend van tientallen tot duizenden per cel, maakt het moeilijk om vol vertrouwentraceren individuele microtubules in de tijd. Vele studies pakken deze uitdaging door beeldvorming eiwitten die selectief lokaliseren microtubuli doeleinden, zoals eiwitten in het einde binding (EB) familie. Echter, deze eiwitten waarvan bekend is uitsluitend gelokaliseerd aan de uiteinden van microtubuli in meercelligen 2. Daarom is het nut van deze eiwitten beperkt tot het rechtstreeks meten van groei, terwijl slechts indirect meten van andere aspecten van de dynamiek, zoals de frequentie van een catastrofe. Ten tweede, ondanks de vooruitgang in het genoom van het bewerken technologie, het creëren van cellen die stabiel fluorescent gelabeld tubuline of het introduceren van mutaties om selectief te manipuleren tubuline of microtubule toezichthouders uit te drukken blijft een belangrijke uitdaging. Bovendien is de aanwezigheid van vele tubuline isotypes in metazoa verwart de studie van hoe mutaties invloed hebben op de individuele tubuline genen.
Het gist-systeem biedt een aantal belangrijke voordelen voor het meten van in vivo microtubule dynamiek. Gist een vereenvoudigd microtubule netwerk dat visualisatie van individuele microtubules toelaat. In gist microtubules afkomstig uit het organiseren centra bekend als spil poolelementen (SPBs), die zijn ingebed in de kern envelop 3. De SPBs dienen als scaffolds voor γ-tubuline kleine complexen die microtubules 4, 5 kiemen. SPBs nucleëren twee klassen van microtubuli, spindel microtubuli en astrale microtubuli. Spindel microtubuli uitsteken in de nucleoplasma en zijn belangrijk voor bevestiging aan chromosomen via kinetochoor microtubuli en voor het stabiliseren van de spil via overlappende interpolaire microtubuli 6. Daarentegen worden microtubuli stervormig naar buiten uitsteken in de cytosol en relatief zeldzaam in vergelijking met het dichte net van spindel microtubuli. Tijdens de mitose, pre-anafase cellen slechts 1-2 stervormig microtubules afkomstig van ofwel SPB; deze bestaan als individuele microtubuli plaats van als bundels 7. De rol van stervormige microtubuli tijdens mitose is om de kern en spil verplaatsen naar de verbinding tussen de moeder en knop compartimenten, bekend als het gewas hals. Deze beweging gaat goed gedefinieerde paden die te genereren op stervormige microtubules, trekken de kern en de spil naar en uiteindelijk in de kiem hals 8.
Een ander voordeel van het gistsysteem is het nut van de genetica, die kan worden gebruikt om microtubuli regelaars en tubuline subeenheden onderzoeken met ongekende nauwkeurigheid. Gist bezitten ook een vereenvoudigde repertoire van tubuline isotypen: een β-tubuline-gen (tub2) en twee α-tubuline-genen (TUB1 en TUB3). Mutaties kunnen gemakkelijk worden ingebracht in deze genen en daardoor bestudeerd in een homogene tubuline populatie 9, 10. Er zijn een aantal grote schaalbeschikbaar constructen voor labeling microtubuli, en deze kunnen worden gericht voor integratie op chromosomale loci voor stabiele expressie (zie discussie).
Het algemene doel van deze methode is enkel beeld microtubuli in levende gistcellen in vier dimensies (X, Y, Z en T) voor hoge-resolutie metingen dynamiek van microtubuli. Werkwijzen voor het integreren van constructen voor de constitutieve, lage expressie van fluorescent gelabeld tubuline in gistcellen beschreven. Voorafgaand aan beeldvorming worden levende cellen gemonteerd op slede kamers bekleed met de lectine Concanavaline A aan de cellen op lange termijn imaging stabiliseren. De optimale parameters voor beeldopname, alsook een werkstroom voor gegevensanalyse, worden ook beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gist model biedt grote voordelen voor het verzamelen van hoge-resolutie metingen van de dynamiek van microtubuli in een in vivo setting, inclusief de mogelijkheid om enkel beeld microtubules loop van de tijd en het vermogen om tubulines en microtubule toezichthouders gebruik van de tools van gist genetica te manipuleren.
De concanavaline A-beklede kamers bieden een aantal voordelen ten opzichte van eerder beschreven inrichtingen, met inbegrip van gesmolten agar pads. Objectglaasj…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Kerry Bloom (Universiteit van North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University) en Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) voor het delen van diverse FP-TUB1 plasmiden. We zijn dankbaar voor Melissa Gardner (Universiteit van Minnesota) voor ons trainen in de schuif kamer bereidingswijze. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verlenen R01GM112893-01A1 (naar JKM) en T32GM008730 (CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Génétique. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochimie. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
