Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Summary

Vi beskriver en teknik för användning av murina embryonala stamceller för generering av två eller tre dimensionella embryoidkroppar. Vi förklarar sedan hur man framkalla neural differentiering av embryoida kroppens celler av retinoinsyra och hur man analyserar deras tillstånd av differentiering av stamceller markör immunofluorescens och immunoblotting.

Abstract

Mus embryonala stamceller (ESC) som isolerats från den inre massan av blastocysten (typiskt vid dag E3.5), kan användas som in vitro-modellsystem för att studera tidig embryonal utveckling. I frånvaro av leukemihämmande faktor (LIF), ESC differentierar som standard till neurala prekursorceller. De kan samlat till en tredimensionell (3D) sfäriska aggregat benämnda embryoid kropp (EB) på grund av dess likhet med det tidiga stadiet embryot. EBs kan ympas på fibronektinbelagda täckglas, där de expanderar genom att odla två dimensionella (2D) förlängningar, eller implanteras i 3D kollagenmatriser där de fortsätter att växa som sfäroider, och differentierar till de tre groddblad: endodermala, mesodermala och ektodermalt. 3D collagen kulturen härmar in vivo miljö närmare än 2D EBS. 2D EB kulturen underlättar analys genom immunofluorescens och immunoblotting att spåra differentiering. Vi har utvecklat en tvåstegs neural differentieringtion-protokollet. I det första steget, är EBs genereras av hängdropp- teknik, och, samtidigt, induceras att differentiera genom exponering för retinsyra (RA). I det andra steget, neurala differentieringsfortskrider i en 2D- eller 3D-format i frånvaro av RA.

Introduction

ESCs härrör från blastocysten inre cellmassan. Dessa celler är pluripotenta, dvs de har förmågan att differentieras till alla celltyper hos organismen ursprungsland. ESC in vitro differentiering är av stort intresse som ett experimentellt system för att utreda utvecklingsvägar och mekanismer. Det erbjuder en potent och flexibel modell för att testa nya terapeutiska metoder för korrigering av cell- och vävnads dysfunktion. EB rekapitulera många aspekter av celldifferentiering under tidig embryogenes. I synnerhet, kan EBs användas när embryonal dödlighet gör det svårt att bestämma den cellulära basen av de embryonala defekter ^{1, 2.} EBs kan bildas antingen av den hängande droppen eller vätskesuspensionstekniker ^3. Fördelen av den förra är förmågan att generera EBs av konsekvent storlek och densitet, vilket underlättar experimentell reproducerbarhet.

<p class = "jove_content"> Interaktion med extracellulära matrix (ECM) adhesionsproteiner kan påverka motilitet och överlevnad av vidhäftande celler. I 2D-odlingssystemet, är fibronektin ofta tillämpas för att öka cellvidhäftning till substratet. Fibronektin är ett basal lamina komponent som känns igen av 10 typer av cellytan grin heterodimerer ^4.

RA är en liten lipofil metabolit av vitamin A som inducerar neural differentiering ^{5, 6.} Höga koncentrationer av RA främja neural genexpression och undertrycker mesodermala genuttryck under EB formation ^{7, 8.} RA är producerad av vitamin A oxidation till retinaldehyd genom antingen alkohol eller retinol dehydrogenas, följt av retinaldehyd oxidation till den slutliga produkten genom retinaldehyd dehydrogenas ^9. Neural differentiering kräver transport av RA från cytoplasman till kärnan genom cellulär RA-bindande protein 2 (CRABP2). I kärnan, binder RA till dess besläktade receptor komplex bestående av en RAR-RXR heterodimer ^10. Detta resulterar i rekrytering av transkriptionella co-aktivatorer, och initieringen av transkription ^{9, 11.} Vidare RA befrämjar nedbrytningen av fosforylerade (aktiva) Smad1, således antagonisera BMP och SMAD signalering ^12. Förutom dessa aktiviteter ökar RA Pax6 uttryck, en transkriptionsfaktor som stöder neural differentiering ^13. RA-signalering moduleras av sirtuin-1 (SIRT1), en nukleär nikotinamidadenindinukleotid (NAD +) – beroende enzym som deacetylates CRABP2, interferera med dess translokation till kärnan, och således med RA bindning till RAR-RXR heterodimer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Vårt mål i utformningen av RA-behandlade EB protokoll som beskrivs här är att optimera neural differentiering för att underlätta in vitro-analys av de signalvägar som reglerar ESC differentiering till neuronala prekursorceller. En av fördelarna med detta protokoll är underlättande av analys av cellfunktionen genom immunofluorescens. 3D EBs är inte väl penetrerad av antikroppar och är svåra att bilden. EB dissociation till en 2D monoskikt vid specifika tidpunkter under neural differentiering underlättar immunomärkning och avbildning av cellerna genom konfokalmikroskopi.

Protocol

1. Kultur av Mus Embryonala fibroblaster (MEF) Förbereda MEF-medium, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM, hög-glukos), kompletterat med 15% fetalt bovint serum (FBS). Coat 100 mm cellodlingsskålar med 0,5% gelatinlösning under 30 min vid rumstemperatur (RT). Räkna MEFs med användning av en cytometer. Avlägsna gelatinlösning och omedelbart häll MEF-medium förvärmas till 37 ° C. Snabbt tina ampuller med mitomycin C-behandlade MEFs i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter, d?…

Representative Results

Oct4, Nanog och SOX2 är kärntranskriptionsfaktorer som ger ESC självförnyelse och pluripotens. Vi tillämpade ovanstående protokoll för att jämföra den neurala differentieringen av ESCs från vildtyp och från en stam av genetiskt modifierade möss där Syx, en gen som kodar för det RhoA specifika utbyte faktor Syx, störs. Vi hade inblandad Syx i angiogenes 18. Vi märkte skillnader i beteenden EBS aggregerade från Syx + / +…

Discussion

I detta protokoll presenterar vi ett relativt enkelt och tillgänglig metod för att studera neural differentiering av murina ESCs. I tidigare protokoll, till RA till mediet vid dag 2 eller dag 4 av EB hängdropp- ⁸ eller genom suspensionsodling ^7, respektive, eller omedelbart efter EB hängande droppe aggregering ^21. I protokollet vi fram var RA lagt tidigare. Trots den tidigare införandet av RA till EBS bildas av suspensionskultur, producerade de…

Materials

Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging