تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد
Summary
نحن تصف تقنية لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في الفئران لتوليد اثنين أو ثلاث جثث مضغي الأبعاد. نحن ثم شرح كيف للحث على تمايز العصبي من خلايا الجسم مضغي من حمض الريتينويك، وكيفية تحليل حالتهم التمايز عن طريق خلية سلفية المناعي علامة وimmunoblotting.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) معزولة عن الكتلة الداخلية من الكيسة الأريمية (عادة في E3.5 اليوم)، ويمكن أن تستخدم في المختبر نظام نموذجي لدراسة التطور الجنيني المبكر. في حالة عدم وجود عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تفرق افتراضيا في الخلايا العصبية السلائف. ويمكن جمع إلى ثلاثي الأبعاد (3D) ووصف مجموع كروية الجسم مضغي (EB) نظرا لتشابهه مع الجنين مرحلة مبكرة. EBS يمكن المصنف coverslips على فبرونيكتين المغلفة، حيث أنها توسع من خلال زراعة اثنين الأبعاد (2D) التمديدات، أو زرع في مصفوفات الكولاجين 3D حيث تواصل نموها كما الكروية، وتفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم الباطن، أرومية متوسطة، والأدمة. ثقافة الكولاجين 3D يحاكي البيئة في الجسم الحي بشكل وثيق من 2D EBS. ثقافة 2D EB تسهل التحليل المناعي وimmunoblotting لتتبع التمايز. لقد قمنا بتطوير من خطوتين فارق العصبيبروتوكول نشوئها. في الخطوة الأولى، يتم إنشاء EBS بواسطة تقنية شنقا الإفلات، و، في وقت واحد، والتي يسببها للتمييز عن التعرض لحمض الريتينويك (RA). في الخطوة الثانية، وعائدات التمايز العصبية في شكل 2D أو 3D في غياب RA.
Introduction
المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكيسة الكتلة الخلوية الداخلية. هذه الخلايا هي المحفزة، أي أنها تملك القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا في الكائن الأصلي. ESC في المختبر التمايز هو من اهتمام واسع كنظام تجريبي للتحقيق في مسارات وآليات التنموية. ويقدم نظام نموذجي قوي ومرن لاختبار أساليب علاجية جديدة لتصحيح الخلايا والأنسجة الخلل. EBS تلخيص جوانب كثيرة من تمايز الخلايا خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. على وجه الخصوص، EBS يمكن استخدامها عند الفتك الجنينية يجعل من الصعب تحديد الأساس الخلوي للعيوب الجنينية 1 و 2. EBS يمكن أن تتكون إما من قبل قطرة شنقا أو تقنيات تعليق السائلة 3. ميزة السابق هو القدرة على توليد EBS من حجم ثابت وكثافة، مما يسهل استنساخ التجربة.
<p cمعشوقة = "jove_content"> التفاعل مع الخلية البروتينات التصاق مصفوفة (ECM) قد تؤثر على القدرة على الحركة وبقاء الخلايا الملتصقة. في نظام الثقافة 2D، وغالبا ما يتم تطبيق فبرونيكتين لزيادة التصاق الخلية إلى الركيزة. فبرونيكتين عنصرا الصفيحة القاعدية التي تعترف بها 10 أنواع من سطح الخلية إنتغرين heterodimers 4.RA هو الأيض للدهون صغيرة من فيتامين (أ) الذي يسبب العصبية التمايز 5، 6. تركيزات عالية من RA تعزيز التعبير الجيني العصبي وتقمع التعبير الجيني أرومية متوسطة خلال تشكيل EB 7 و 8. ويتم إنتاج RA فيتامين ألف الأكسدة لريتينالديهيد إما عن طريق الكحول أو الريتينول نازعة، تليها الأكسدة ريتينالديهيد إلى المنتج النهائي من قبل ريتينالديهيد نازعة 9. التمايز العصبي يتطلب نقل RA من السيتوبلازم إلى النواة التي الخلوي ملزم RA بروتين 2 (CRABP2). في النواة، RA تربط لمجمعها مستقبلات وما شابه ذلك تتألف من مغاير RAR-RXR 10. وهذا يؤدي إلى توظيف النسخي شارك في تفعيل، والشروع في النسخ 9 و 11. وعلاوة على ذلك، RA يعزز تدهور فسفرته (نشط) SMAD1، وبالتالي استعداء BMP وSMAD يشير 12. وبالإضافة إلى هذه الأنشطة، RA يزيد التعبير Pax6، وهو عامل النسخ التي تدعم العصبية التمايز 13. والتضمين إشارات RA التي كتبها sirtuin-1 (SIRT1)، وثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد النووي (NAD +) – انزيم يعتمد ذلك deacetylates CRABP2، والتدخل مع النبات لالنواة، وبالتالي مع RA ملزمة لمغاير RAR-RXR 14، 15، 16.
e_content "> هدفنا في تصميم بروتوكول EB تعامل RA-الموصوفة هنا هو تحسين التمايز العصبي من أجل تسهيل في المختبر تحليل مسارات الإشارات التي تنظم ESC التمايز في الخلايا العصبية السلائف. واحدة من مزايا هذا البروتوكول هو تيسير تحليل وظيفة الخلية التي كتبها المناعي. 3D EBS لم يتم اختراقها بشكل جيد من قبل الأجسام المضادة ويصعب الصورة. تفارق EB إلى أحادي الطبقة 2D في نقطة زمنية محددة خلال التمايز العصبي يسهل immunolabeling والتصوير من الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول نقدم طريقة بسيطة نسبيا ويمكن الوصول إليها لدراسة التمايز العصبي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران. في البروتوكولات السابقة، وأضيف RA إلى متوسطة في يوم 2 أو يوم 4 من EB شنقا الإفلات 8 أو ثقافة تعليق 7، على التوالي، أو م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 HL119984 إلى AH
Materials
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
