Summary

Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

Published: April 22, 2017
doi:

Summary

We beschrijven een werkwijze voor het gebruiken van muriene embryonale stamcellen voor het genereren van twee- of driedimensionaal embryoïde lichamen. Vervolgens hebben we uitgelegd hoe neurale differentiatie van de embryoid lichaamscellen door retinolzuur, en hoe ertoe te bewegen hun staat van differentiatie te analyseren door voorlopercellen cel marker immunofluorescentie en immunoblotting.

Abstract

Muis embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de binnenste massa van de blastocyst (gewoonlijk op dag E3.5), kan worden gebruikt als in vitro modelsysteem voor het bestuderen vroege embryonale ontwikkeling. Bij afwezigheid van leukemie remmende factor (LIF), SER differentiëren standaard tot neurale voorlopercellen. Ze kunnen worden vergaard in een driedimensionale (3D) sferisch aggregaat aangeduid embryoiden lichaam (EB) vanwege zijn gelijkenis met het vroege stadium embryo. EBS kunnen worden gezaaid op fibronectine beklede dekglaasjes, waar ze uitbreiden door kweken tweedimensionale (2D) extensies of geïmplanteerd in 3D collageenmatrices waar ze blijven groeien als sferoïden en differentiëren tot drie kiembladen: endodermale, mesodermale en ectodermale. De 3D collageen cultuur bootst de in vivo omgeving beter dan de 2D-EBS. De 2D EB cultuur vergemakkelijkt de analyse van immunofluorescentie en immunoblotting om differentiatie te volgen. We hebben een twee-staps neurale differentia ontwikkeldtie protocol. In de eerste stap worden EB opgewekt door de hangende druppel techniek en tegelijkertijd worden geïnduceerd om te differentiëren door blootstelling aan retinoïnezuur (RA). In de tweede stap neurale differentiatie verloopt in een 2D- of 3D-formaat bij afwezigheid van RA.

Introduction

SER afkomstig van de blastocyst binnenste celmassa. Deze cellen zijn pluripotent, dat wil zeggen zij hebben het vermogen om te differentiëren in elk celtype van het organisme van herkomst. ESC in vitro differentiatie is van groot belang als een experimenteel systeem voor het onderzoeken van ontwikkelingstrajecten en mechanismen. Het biedt een krachtige en flexibele modelsysteem om nieuwe therapeutische benaderingen voor de correctie van cellen en weefsels dysfunctie te testen. EBS recapituleren vele aspecten van celdifferentiatie tijdens de vroege embryogenese. In het bijzonder kan EBS worden gebruikt wanneer embryonische letaliteit bemoeilijkt de cellulaire basis van de embryonale gebreken 1, 2 bepalen. EBS kan hetzij worden gevormd door de hangende druppel of vloeibare suspensietechnieken 3. Het voordeel van de eerste is de mogelijkheid om EB consistente grootte en dichtheid te genereren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid vergemakkelijkt.

<p class = "jove_content"> interactie met extracellulaire matrix (ECM) adhesie eiwitten kunnen de motiliteit en overleving van hechtende cellen beïnvloeden. In de 2D-cultuur systeem, wordt fibronectine vaak toegepast op cel adhesie te verhogen tot het substraat. Fibronectine is een basale lamina component herkend door 10 soorten celoppervlak integrine heterodimeren 4.

RA is een kleine lipofiele metaboliet van vitamine A die neurale differentiatie 5, 6 induceert. Hoge concentraties van RA bevorderen neurale genexpressie en onderdrukt mesodermale genexpressie tijdens EB vorming 7, 8. RA wordt door vitamine A oxidatie tot retinaldehyde door een alcohol of retinol dehydrogenase, gevolgd door retinaldehyde oxidatie tot het uiteindelijke product door retinaldehyde dehydrogenase 9. Neurale differentiatie vereist transport van RA uit het cytoplasma de kern van cellulaire RA-bindend eiwit 2 (CRABP2). In de kern, RA bindt aan de verwante receptor complex van een RAR-RXR heterodimeer 10. Dit leidt tot rekrutering van transcriptionele co-activatoren, en initiatie van transcriptie 9, 11. Bovendien RA bevordert de afbraak van gefosforyleerd (actieve) Smad1, dus tegenwerken van BMP en Smad signalering 12. Naast deze activiteiten RA verhoogt Pax6 expressie, een transcriptiefactor die neuronale differentiatie 13 ondersteunt. RA signalering wordt gemoduleerd door sirtuine-1 (Sirt1), een nucleair nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) – afhankelijk enzym dat CRABP2 deacetylates interfereren met zijn translocatie naar de kern, en dus met RA binding aan de RAR-RXR heterodimeer 14, 15, 16.

e_content "> Ons doel bij het ontwerpen van de RA-behandelde EB protocol hier beschreven neurale differentiatie optimaliseren om in vitro analyse van de signaleringspaden die ESC differentiatie reguleren in neuronale voorlopercellen te vergemakkelijken. Een voordeel van dit protocol is vergemakkelijking van de analyse van celfunctie door immunofluorescentie. 3D EB's niet goed gepenetreerd door antilichamen en moeilijk beeld. EB dissociatie in een 2D monolaag op specifieke tijdstippen tijdens neurale differentiatie bevordert immunokleuring en beeldvorming van de cellen met confocale microscopie.

Protocol

1. Cultuur van de muis embryonale fibroblasten (MEF) Bereiden MEF medium, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM hoge glucose) aangevuld met 15% foetaal runderserum (FBS). Coat 100 mm celcultuurschalen met 0,5% gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Count MEF met behulp van een cytometer. Verwijder de gelatineoplossing en giet onmiddellijk MEF medium voorverwarmd tot 37 ° C. Snel ontdooien flesjes mitomycine-C behandelde MEFs in een 37 ° C waterbad gedure…

Representative Results

Oct4, Nanog, en SOX2 de kern transcriptiefactoren die ESC zelfvernieuwing en pluripotentie verlenen. We pasten bovenstaande protocol bij de neurale differentiatie van SER vergelijken van wild type en van een stam van genetisch gemodificeerde muizen waarbij Syx, een gen dat codeert voor het RhoA specifieke exchange factor Syx wordt verstoord. We hadden Syx betrokken bij angiogenese 18. Wij merkten verschillen in het gedrag van EBS geaggregeerde van Syx…

Discussion

In dit protocol presenteren we een betrekkelijk eenvoudige en toegankelijke wijze neurale differentiatie van muis SER bestuderen. In eerdere protocollen werd RA toegevoegd aan het medium op dag 2 en dag 4 van de EB hangende-druppel 8 of suspensiecultuur 7, respectievelijk, of onmiddellijk na de EB opknoping druppel 21 aggregatie. In het protocol we bedacht, werd RA eerder toegevoegd. Ondanks de eerdere invoering van RA EBS gevormd door suspensiekwee…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidie ​​R01 HL119984 AH

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

View Video