Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Summary

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Abstract

Embryonale Stammzellen der Maus (WSR) von der Innenmasse der Blastozyste isoliert ( in der Regel am Tag E3.5) können für die Untersuchung der frühe Embryonalentwicklung als de – vitro – Modellsystem verwendet werden. In Abwesenheit von Leukämie-Hemmfaktor (LIF), unterscheidet WSR standardmäßig in neuralen Vorläuferzellen. Sie können in einer dreidimensionalen (3D) angehäuft werden, um sphärische Aggregat bezeichnet Embryoidkörperbildung (EB) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem frühen Stadium Embryo. EBs auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser ausgesät werden, wo sie von wachsenden zweidimensionale (2D) Erweiterungen oder implantiert in 3D-Kollagen-Matrices erweitern, wo sie als Sphäroiden weiter wachsen und differenzieren sich in die drei Keimblätter: endodermisches, mesodermalen und ektodermalen. Die 3D – Kollagen Kultur ahmt die de – vivo – Umgebung näher als der 2D – EBs. Die 2D-EB Kultur erleichtert Analyse von Immunfluoreszenz und Immunoblotting Differenzierung zu verfolgen. Wir haben einen zweistufigen neuronalen Differenzierung entwickeltmunikationsprotokoll. Im ersten Schritt wird EBs durch die Hanging-Drop-Technik erzeugt werden, und, gleichzeitig, induziert durch Exposition gegenüber Retinsäure (RA) zu differenzieren. Im zweiten Schritt, neuronalen Differenzierung erfolgt in einem 2D- oder 3D-Format in Abwesenheit von RA.

Introduction

WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embryonalen Defekte ^{1, 2} zu bestimmen. EBs können ³ durch den hängenden Tropfen oder flüssigen Suspensionstechniken gebildet entweder werden. Der Vorteil des ersteren ist die Fähigkeit, EBs konsistenter Größe und Dichte zu erzeugen, so dass experimentelle Reproduzierbarkeit zu erleichtern.

<p class = "„jove_content“"> Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix (ECM) Adhäsionsproteine ​​kann die Beweglichkeit und das Überleben von adhärenten Zellen beeinflussen. In dem 2D-Kultursystem wird oft Fibronektin zu erhöhen Zelladhäsion auf das Substrat aufgebracht. Fibronectin ist eine Basallamina Komponente um 10 Arten von Zelloberflächen – Integrin – Heterodimeren erkannt ^4.

RA ist ein kleines lipophiles Metabolit von Vitamin A , das ⁵ neurale Differenzierung ^{induziert, 6.} Hohe Konzentrationen von RA Förderung neuronaler Genexpression reprimiert und mesodermalen Genexpression während der EB Bildung ^{7, 8.} RA wird durch Vitamin – A – Oxidation Retinaldehyd entweder durch Alkohol oder Retinol – Dehydrogenase, gefolgt von Retinaldehyd Oxidation zum Endprodukt durch Retinaldehyd dehydrogenase ⁹ hergestellt. Neuronale Differenzierung erfordert Transport von RA aus dem Cytoplasma an den Kern durch zelluläre RA-bindendes Protein 2 (CRABP2). Im Kern bindet RA an seinen zugehörigen Rezeptor – Komplex , bestehend aus einem RAR-RXR – Heterodimer ^10. Dies führt bei der Rekrutierung von Transkriptions Co-Aktivator, und der Initiation der Transkription ^{9, 11.} Darüber hinaus fördert die RA den Abbau von phosphoryliertem (aktiv) SMAD1, wodurch BMP und SMAD Antagonisierung ¹² signalisiert. Zusätzlich zu diesen Aktivitäten erhöht RA Pax6 – Expression, einen Transkriptionsfaktor, ¹³ neuralen Differenzierung unterstützt. RA – Signalisierung moduliert durch sirtuin-1 (Sirt1), ein Kern Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) – abhängiges Enzym , die CRABP2 deacetyliert, mit seiner Translokation in den Zellkern zu stören, und damit mit RA der Bindung an den RAR-RXR – Heterodimer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Unser Ziel der RA-behandelten EB – Protokoll bei der Gestaltung hier beschriebene neuronale Differenzierung zu optimieren , um de – vitro – Analyse der Signalwege zu erleichtern , die ESC Differenzierung in Zellen neuronalen Vorläufer regulieren. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Erleichterung der die Analyse der Zellfunktion durch Immunofluoreszenz. 3D EBs ist gut nicht durch Antikörper durchdrungen und ist schwer zu Bild. EB Dissoziation in einen 2D-Monolayer zu bestimmten Zeitpunkt während der neuronalen Differenzierung und Immunomarkierung Bildgebung der Zellen durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

Protocol

1. Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Bereiten MEF Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, high-glucose), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS). Coat 100 mm Zellkulturschalen mit 0,5% Gelatine-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Graf MEFs mit einem Durchflusszytometer. Entfernen der Gelatinelösung und sofort gießen MEF Medium vorgewärmt auf 37 ° C. Schnell auftauen Phiolen von Mitomycin C-behandeln MEFs in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min, d…

Representative Results

Oct4, Nanog und SOX2 sind die Kerntranskriptionsfaktoren, die ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wir wandten das obige Protokoll , um die neuronale Differenzierung von WSR vom Wildtyp und aus einem Stamm von genetisch veränderten Mäusen , wo Syx, ein Gen , kodierend für das RhoA spezifische exchange factor Syx, gestört zu vergleichen. Wir hatten Syx in 18 Angiogenese beteiligt. Wir bemerkten Unterschiede im Verhalten von EBs von Syx</…

Discussion

In diesem Protokoll stellen wir eine relativ einfache und zugängliche Methode neuronale Differenzierung von murinen WSR zu studieren. In vorangegangenen Protokollen wurde RA auf das Medium am Tag 2 oder Tag hinzugefügt 4 des EB hängenden Tropfen ⁸ oder durch Suspensionskultur bzw. ^7, oder unmittelbar nach der Tropfenaggregation EB ²¹ hängt. In dem Protokoll wir erdacht wurde RA früher gegeben. Trotz der früheren Einführung von RA zu EBs durch…

Materials

Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging