दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण

Summary

हम दो या तीन आयामी embryoid निकायों पैदा करने के लिए murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए एक तकनीक का वर्णन। हम तो रेटिनोइक एसिड, और कैसे द्वारा embryoid शरीर की कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव प्रेरित करने के लिए कैसे पूर्वज सेल मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoblotting द्वारा भेदभाव के अपने राज्य का विश्लेषण करने के लिए समझाने।

Abstract

माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) ब्लास्टोसिस्ट (आमतौर पर दिन E3.5 पर) के भीतर बड़े पैमाने पर से अलग, जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) के अभाव में, ESCs तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं में डिफ़ॉल्ट रूप से अंतर। वे प्रारंभिक चरण भ्रूण को इसकी समानता के कारण एक तीन आयामी (3 डी) में जमा कर रखे जा सकती है, गोलाकार कुल embryoid शरीर (ईबी) करार दिया। ईबीएस, फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है जहां वे दो आयामी (2 डी) एक्सटेंशन बढ़ रही द्वारा विस्तार, या 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स, जहां वे spheroids के रूप में बढ़ जारी रखने, और तीन रोगाणु परतों में भेद में प्रत्यारोपित: endodermal, mesodermal, और बहिर्जनस्तरीय। 3 डी कोलेजन संस्कृति 2 डी ईबीएस की तुलना में अधिक बारीकी से इन विवो वातावरण की नकल करता। 2 डी ईबी संस्कृति इम्यूनोफ्लोरेसेंस और भेदभाव को ट्रैक करने के immunoblotting द्वारा विश्लेषण की सुविधा। हम एक दो कदम तंत्रिका वैशिष्ट्य का विकास किया हैtion प्रोटोकॉल। पहले चरण में, ईबीएस फांसी ड्रॉप तकनीक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, और, एक साथ, रेटिनोइक एसिड (आरए) के संपर्क से अलग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। दूसरे चरण में, आरए के अभाव में एक 2 डी या 3 डी प्रारूप में तंत्रिका भेदभाव आय।

Introduction

ESCs ब्लास्टोसिस्ट आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उत्पन्न होते हैं। इन कोशिकाओं को, pluripotent हैं यानी वे मूल के जीव के किसी भी प्रकार की कोशिका में अंतर करने के लिए क्षमता है। ESC इन विट्रो भेदभाव विकास के रास्ते और तंत्र की जांच के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में व्यापक ब्याज की है। यह सेल और ऊतक शिथिलता के सुधार के लिए नई चिकित्सा दृष्टिकोणों को परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। ईबीएस जल्दी embryogenesis दौरान सेल भेदभाव के कई पहलुओं पुनरावृत्ति। विशेष रूप से, ईबीएस जब भ्रूण घातकता को यह मुश्किल भ्रूण दोष ^{1, 2} के सेलुलर आधार निर्धारित करने में आता है इस्तेमाल किया जा सकता। ईबीएस फांसी ड्रॉप या तरल निलंबन तकनीक ³ से या तो गठित किया जा सकता। पूर्व का लाभ लगातार आकार और घनत्व के ईबीएस उत्पन्न करने के लिए, इस प्रकार प्रयोगात्मक reproducibility को सुविधाजनक बनाने की क्षमता है।

<p cलड़की = "jove_content"> बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन प्रोटीन के साथ बातचीत गतिशीलता और पक्षपाती कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता। 2 डी संस्कृति प्रणाली में, फ़ाइब्रोनेक्टिन अक्सर सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए आवेदन किया है। फ़ाइब्रोनेक्टिन एक आधारी पटल घटक heterodimers ⁴ इंटीग्रिन कोशिका-सतह के 10 प्रकार के द्वारा मान्यता प्राप्त है।

आरए विटामिन ए कि तंत्रिका भेदभाव ^{5, 6} को प्रेरित करता है की एक छोटी lipophilic मेटाबोलाइट है। आरए की उच्च सांद्रता तंत्रिका जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने और ईबी गठन ^{7, 8} के दौरान mesodermal जीन अभिव्यक्ति represses। आरए एक ऑक्सीकरण विटामिन या तो शराब या रेटिनोल डिहाइड्रोजनेज, retinaldehyde डिहाइड्रोजनेज ⁹ से अंतिम उत्पाद के लिए retinaldehyde ऑक्सीकरण के बाद से retinaldehyde करने द्वारा निर्मित है। तंत्रिका भेदभाव कोशिका द्रव्य से आरए के परिवहन की आवश्यकता है सेलुलर आरए बाध्यकारी प्रोटीन 2 (CRABP2) द्वारा नाभिक के लिए। नाभिक में, आरए अपने सजातीय रिसेप्टर एक RAR-RXR heterodimer के ¹⁰ से मिलकर जटिल को बांधता है। यह ट्रांस्क्रिप्शनल सह activators की भर्ती, और प्रतिलेखन ^{9, 11} की दीक्षा का परिणाम है। इसके अलावा, आरए फॉस्फोरिलेटेड (सक्रिय) SMAD1 की गिरावट को बढ़ावा देता है, इस प्रकार बीएमपी और SMAD संकेत ¹² antagonizing। इन गतिविधियों के अलावा, आरए Pax6 अभिव्यक्ति, एक प्रतिलेखन कारक तंत्रिका भेदभाव ¹³ का समर्थन करता है कि बढ़ जाती है। आरए संकेतन sirtuin -1 (SIRT1), एक परमाणु निकोटिनामाइड एडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NAD +) द्वारा ठीक किया जाता है – निर्भर एंजाइम है कि CRABP2 deacetylates, नाभिक के लिए अपने अनुवादन के साथ दखल दे, और इसलिए आरए RAR-RXR heterodimer के ^{14, 15} के लिए बाध्य के ^{साथ, 16।}

e_content "> यहाँ वर्णित आरए इलाज ईबी प्रोटोकॉल को डिजाइन करने में हमारा लक्ष्य आदेश संकेत दे रास्ते कि neuronal अग्रदूत कोशिकाओं में ESC भेदभाव को विनियमित की इन विट्रो विश्लेषण की सुविधा में तंत्रिका भेदभाव का अनुकूलन है। इस प्रोटोकॉल के लाभों में से एक की सुविधा है इम्यूनोफ्लोरेसेंस। 3 डी ईबीएस द्वारा कोशिकाओं के कार्य का विश्लेषण अच्छी तरह से एंटीबॉडी द्वारा प्रवेश और दौरान तंत्रिका भेदभाव कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा immunolabeling और कोशिकाओं की इमेजिंग की सुविधा विशिष्ट समय बिंदुओं पर एक 2 डी monolayer में छवि। ईबी पृथक्करण के लिए मुश्किल हैं नहीं कर रहे हैं।

Protocol

1. माउस भ्रूणीय Fibroblasts की संस्कृति (MEFs) MEF मध्यम तैयार करें, Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज), 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक। कोट 100 मिमी कमरे के तापमान पर 30 मिनट (आर टी) के लिए 0.5% जिलेटिन…

Representative Results

Oct4, Nanog, और Sox2 कोर प्रतिलेखन कारक है कि प्रदान के लिए ESC आत्म नवीकरण और pluripotency हैं। हम जंगली प्रकार से और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों जहां Syx, एक जीन RhoA विशेष विनिमय कारक Syx के लिए कोडिंग, बाधित हो?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम murine ESCs के तंत्रिका भेदभाव का अध्ययन करने के एक अपेक्षाकृत सरल और सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं। पिछले प्रोटोकॉल में, आरए दिन 2 या ईबी फांसी ड्रॉप ⁸ में से 4 दिन में या निलंबन संस्क…

Materials

Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC feeder layer
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Cell culture dish (60 mm)	Eppendorf	30701119	Cell culture
Cell culture dish (100 mm)	Falcon	353003	Cell culture
Petri dish (100 mm)	Corning	351029	Hanging drops
24-well plate	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-well plate	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube	Celltreat Scientific Products	229437	RA stock solution
Microscope cover-glass	Fisherbrand	12-545-80	Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides	Fisherbrand	12-550-15
3D collagen culture kit	EMD Millipore	ECM675	3D culture
Effectene Transfection Reagent	Qiagen	301427	Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa)	EMD Millipore	MRCPRT010	Protein concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs culture
IMDM	Gibco	12440-046	ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs culture
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2625	Dish coating
LIF	R&D Systems	8878-LF-025	To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions	Gibco	11140050	Cell culture
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
Gentamicin	Gibco	15750060	Cell culture
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072	Cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
All-trans-retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Blocking and antibody dilution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Cell membrane permeabilization
Cell strainer	Corning	352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI	Life Tech.	P36931	Mounting reagent
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell fixation
Fibronectin	R&D Systems	1030-FN	Dish coating
PBS	Gibco	10010049
Collagenase type I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Detection of neural differentiation
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Detection of neural differentiation
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Detection of neural differentiation
Sox2	Cell Signaling	3579	Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Detection of neural differentiation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488	Life Tech.	A21202	Immunofluorescence
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Wide-field microscope	Nikon	Eclipse TS100	Cell culture imaging
Confocal microscope	Nikon	C2	Immunofluorescence imaging