Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец
Summary
Опишем методику с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток для создания двух или трех размерных эмбриональных телец. Затем мы объясним, как вызывать нейронную дифференцировку эмбриональных клеток организма с помощью ретиноевой кислоты, и как анализировать их состояние дифференцировки клеток-предшественников иммунофлюоресценцией маркеров и иммуноблоттингом.
Abstract
Мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) , выделенные из внутренней массы бластоцисты (обычно в день E3.5), может быть использован как в пробирке модельной системы для изучения раннего эмбрионального развития. При отсутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF), ЭСК дифференцируются по умолчанию в клетки нервных предшественников. Они могут быть накопили в трехмерной (3D) сферический агрегат называется эмбриональное тело (EB) из-за его сходство с ранней стадией эмбриона. ЭТ может быть высевал на фибронектин покрытия покровных, где они расширяются путем выращивания двумерный (2D) расширений, или имплантированный в 3D-матрицах коллагена, где они продолжают расти, как сфероиды и дифференцируются в трех зародышевых слои: эндодермы, мезодермальную и эктодермальных. 3D коллаген культура имитирует среду в естественных условиях более тесно , чем 2D ЭТ. Культура 2D EB облегчает анализ иммунофлюоресценции и иммуноблоттингом для отслеживания дифференциации. Мы разработали два этапа нейронные отличительныеПротокол Тион. На первом этапе, ЭТ генерируются с помощью метода висячей капле, и, одновременно, индуцируются дифференцироваться под воздействием ретиноевой кислоты (RA). На втором этапе, нейронная дифференциация протекает в формате 2D или 3D в отсутствии RA.
Introduction
ЭСК происходит из бластоцисты внутренней клеточной массы. Эти клетки плюрипотентные, то есть они обладают способностью дифференцироваться в любой тип клеток организма происхождения. ESC дифференцировки в пробирке имеет широкий интерес в качестве экспериментальной системы для исследования путей и механизмов развития. Он предлагает мощную и гибкую систему модели для тестирования новых терапевтических подходов для коррекции клеточной и тканевой дисфункции. ЭТ резюмировать многие аспекты дифференцировки клеток на ранних стадиях эмбриогенеза. В частности, ЭТ может быть использован , когда эмбриональная летальность делает его трудно определить клеточную основу эмбриональных дефектов 1, 2. ЭТ может быть образован либо за счет висячей капли или жидких методов подвески 3. Преимущество первого является способность генерировать ЭТ последовательного размера и плотности, что облегчает экспериментальную воспроизводимость.
<p cдеваха = "«jove_content»"> Взаимодействие с внеклеточным матриксом (ECM) белков адгезии может повлиять на подвижность и выживание адгезивных клеток. В системе культуры 2D, фибронектин часто применяются для увеличения адгезии клеток с субстратом. Фибронектина является базальной пластинкой компонент распознается 10 типов клеточной поверхности интегрин гетеродимеров 4.РА представляет собой небольшой липофильный метаболит витамина А , который индуцирует дифференцировку нейронную 5, 6. Высокие концентрации RA способствуют экспрессии генов и нейронную репрессирует экспрессию гена мезодермального в процессе формирования EB 7, 8. РА получают путем окисления витамина А , чтобы ретинальдегида либо спиртом или ретинола дегидрогеназы, с последующим окислением ретинальдегида до конечного продукта с помощью ретинальдегида дегидрогеназы 9. Нейронная дифференциация требует транспорта РА из цитоплазмы к ядру с помощью клеточного белка РА-2 (связывание CRABP2). В ядре РА связывается с родственным рецепторным комплексом , состоящим из гетеродимер RAR-RXR 10. Это приводит к тому набору транскрипционных ко-активаторы и инициации транскрипции 9, 11. Кроме того, РА способствует деградации фосфорилированного (активной) Smad1, таким образом антагонизма BMP и СМАД сигнализации 12. В дополнение к этим деятельности, РА повышает экспрессию Pax6, фактор транскрипции , который поддерживает нейронную дифференциацию 13. Сигнализации РА модулируется Sirtuin-1 (Sirt1), ядерным никотинамидадениндинуклеотид (НАД +) – зависимый фермент , который деацетилирует CRABP2, препятствуя его транслокацию в ядро, и , следовательно , с РА связывания с RAR-RXR гетеродимер 14, 15, 16.
e_content "> Наша цель при разработке RA-обработанную протокол EB , описанный здесь , чтобы оптимизировать нейронную дифференциацию для того , чтобы облегчить анализ витро сигнальных путей , которые регулируют ESC дифференцировку в нейрональные клетки – предшественники. Одним из преимуществ этого протокола является содействие анализ функции клеток с помощью иммунофлюоресценции. 3D ЭТ не хорошо проникает антитела и их трудно изображение. EB диссоциации в 2D монослой в определенные моменты времени в ходе дифференцировка нервная облегчает иммунноокрашивание и визуализацию клеток с помощью конфокальной микроскопии.Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы представляем относительно простой и доступный метод для изучения нейронной дифференцировки мышиных ЭСК. В предыдущих протоколах, РА был добавлен в среду в день 2 или 4 -й день в EB-висячей капли 8 или суспензионной культуры 7, соответственно, и?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом NIH R01 HL119984 в AH
Materials
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
