Misurazione della lipolisi stimolata da Basal e Forskolin nei ghiandoli grassi adiposi inguinali
Summary
Questo protocollo descrive il metodo di determinazione della lipolisi basale e forskolin-stimolata nei pastelli grassi inguinali ottenuti dalla normale dieta di chow (NCD) o dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) ± capsaicina alimentata da topi selvatici. Come indice per la lipolisi, il rilascio di glicerolo è stato misurato dai placche grasse adipose inguinali.
Abstract
La lipolisi è un processo attraverso il quale il lipide immagazzinato come trigliceridi nei tessuti adiposi viene idrolizzato in glicerolo e acidi grassi. In questo articolo viene descritto il metodo per la misura della lipolisi stimolata da basale e forskolin (FSK) nei placchetti grassi inguinali isolati da topi selvatici alimentati sia alla dieta normale di chow (NCD), alla dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) o ad una dieta ad alto contenuto di grassi contenente 0,01 % Di capsaicina (PAC, agonista subfamiglia 1 del vincolo di vanilloide transitorio transitorio (TRPV1)) per 32 settimane. Il metodo descritto qui per l'esecuzione della lipolisi ex vivo è adottato da Schweiger et al. 1 Presentiamo un protocollo dettagliato per misurare i livelli di glicerolo mediante spettrofotometria UV-Visibile (UV / VIS). Il metodo qui descritto può essere utilizzato per isolare con successo i rilievi grassi inguinali per le misurazioni della lipolisi per ottenere risultati coerenti. Il protocollo descritto per i pasticci grassi inguinali può essere facilmente esteso per misurare la lipolisi in altri tessuti.
Introduction
I tessuti adiposi conservano l'energia in quanto il grasso 2 e l'ossidazione dell'acido grasso sono necessari per la termogenesi 3 , 4 . Gli acidi grassi ingeriti attraverso le diete sono confezionati insieme ad apoproteine in chimomicroni e consegnati a diversi tessuti nel corpo attraverso la circolazione del sangue. Anche se la maggior parte delle cellule del corpo conserva una riserva di energia, il tessuto adiposo conserva l'energia in eccesso come grasso 5 , 6 . La lipolisi nel tessuto adiposo è regolata da processi complessi ei dettagli molecolari della lipolisi rimangono ancora vaghi 7 .
La lipolisi è un processo attraverso il quale i trigliceridi (TGL) immagazzinati nel tessuto adiposo vengono idrolizzati per produrre glicerolo e acidi grassi (FA) dall'enzima liposica adiposa triglicerida (ATGL) 8 . Le alterazioni nella lipolisi basale e stimolata sono una caratteristica dell'obesità. Il bLa lipolisi asale è regolata dall'attivazione ATGL 9 , che converte TGL in diacylglycerol (DAG), che viene successivamente idrolizzato in monoacil glicerolo (MAG). L'attivazione della lipasi sensibile all'ormone (HSL) tramite l' adenilil ciclasi attiva la stimolazione della proteina kinasi A (PKA) dipendente dalla adenosina monofosfata (cAMP) e provoca la lipolisi. La misurazione della lipolisi, basale e stimolata, è quindi importante per analizzare l'attività delle proteine coinvolte in questo processo. Inoltre, distruggere la regolazione molecolare della lipolisi può essere utile per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro l'obesità 10 . Poiché le molecole che stimolano la lipolisi e l'ossidazione dell'acido grasso sono potenziali candidati per la riduzione dei grassi conservati nei depositi, è importante impiegare un saggio robusto per la riproducibilità.
I dati precedentemente pubblicati suggeriscono che l'attivazione della proteina TRPV1 espressa in tessuto adiposo bianco per CAP basale miglioratoE FSK (attivazione di adenilil ciclasi) – lipolisi stimolata nei pad grassi inguinali 11 . Precedenti ricerche suggeriscono anche che l'attivazione a lungo termine di TRPV1 da parte della PAC attiva PKA 12 . Dal momento che l'attivazione della PKA stimola la lipolisi 13 , 14 , misurando sia la lipolisi stimolata basale sia PKA-dipendente in placche grasso inguinale isolate da topi NCD o HFD (± CAP) dopo 32 settimane di alimentazione delle rispettive diete convalideranno il ruolo di TRPV1 Attivazione nella lipolisi.
Questo articolo descrive un metodo efficiente per determinare la lipolisi basale e stimolata. Sebbene siano disponibili altri metodi che impiegano isotopi radioattivi di glicerolo e cemente cromatografica a massa ad alta prestazione o gas cromatografia / spettrometria di massa per le misurazioni 15 , 16 , questo metodo offre un metodo più diretto, semplice e convenienteTecnica per determinare la lipolisi nei tessuti adiposi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo di rottura di TGL in glicerolo e acidi grassi è catalizzato da ATGL 9 durante la lipolisi basale e orchestrato da una serie di proteine, tra cui l'attivazione del percorso adenilil ciclasi / PKA dipendente durante la lipolisi stimolata 21 , 22 , 23 . L'aumento della lipolisi aumenta i livelli plasmatici degli acidi grassi per il trasporto e l'utilizzo di energia <sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal premio AHA No. 15BGIA23250030, l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali della NIH sotto il numero di premio 8P20 GM103432-12 e dall'Università del Wyoming Facoltà Grant in Aid to BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
