Mätning av basal och forskolinstimulerad lipolys i fettkorgar i fettad adiposa
Summary
Detta protokoll beskriver metoden för bestämning av basal och forskolinstimulerad lipolys i inguinal fettkuddar erhållna från normala chow diet (NCD) eller fettsyrat möss med hög fetthalt (HFD) ± capsaicin. Som ett index för lipolys mättes glycerolfrisättning från inguinal adiposa fettkuddar.
Abstract
Lipolys är en process genom vilken lipiden lagrad som triglycerider i fettvävnader hydrolyseras till glycerol och fettsyror. I denna artikel beskrivs metoden för mätning av basal och forskolin (FSK) -stimulerad lipolys i de inguinala fettkuddarna isolerade från vildtypsmus matade antingen normal chow diet (NCD), hög fetthalt (HFD) eller en hög fet diet innehållande 0,01 % Av capsaicin (CAP; transient receptorpotential vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist) i 32 veckor. Metoden som beskrivs här för att utföra ex vivo lipolys antas från Schweiger et al. 1 Vi presenterar ett detaljerat protokoll för mätning av glycerolhalter genom UV-synlig (UV / VIS) spektrofotometri. Metoden som beskrivs här kan användas för att framgångsrikt isolera ingående fettkuddar för lipolysmätningar för att erhålla konsekventa resultat. Protokollet som beskrivs för inguinal fettkuddar kan lätt förlängas för att mäta lipolys i andra vävnader.
Introduction
Fettvävnader lagrar energi eftersom fett 2 och fettsyraoxidation krävs för termogenes 3 , 4 . Fettsyror som intagas genom dieter förpackas tillsammans med apoproteiner i chylomikroner och levereras till olika vävnader i kroppen via blodcirkulationen. Även om de flesta celler i kroppen lagrar en reserv av energi, lagrar fettvävnad överflödig energi som fett 5 , 6 . Lipolys i fettvävnad regleras av komplexa processer och molekylära detaljer av lipolys förblir fortfarande vaga 7 .
Lipolys är en process genom vilken triglycerider (TGL) som lagras i fettvävnad hydrolyseras för att producera glycerol och fettsyror (FA) av enzymet adipos triglycerid lipas (ATGL) 8 . Förändringar i basal och stimulerad lipolys är en karakteristisk egenskap hos fetma. BAsal lipolys regleras av ATGL-aktivering 9 , som omvandlar TGL till diacylglycerol (DAG), som därefter hydrolyseras till monoacylglycerol (MAG). Aktivering av hormonkänsligt lipas (HSL) via adenylylcyklas aktiverar stimulering av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) beroende av proteinkinas A (PKA) och orsakar lipolys. Mätning av lipolys, basal och stimulerad, är därför viktigt för att analysera aktiviteten hos proteiner som är involverade i denna process. Vidare kan upplösning av molekylär reglering av lipolys vara till nytta för att utveckla nya terapeutiska strategier mot fetma 10 . Eftersom molekyler som stimulerar lipolys och fettsyraoxidation är potentiella kandidater för minskande fetter som lagras i depåer är det viktigt att använda en robust analys för reproducerbarhet.
Tidigare publicerade data antyder att aktivering av TRPV1-protein uttryckt i vit fettvävnad med CAP-förstärkt basalOch FSK (adenylylcyklasaktivator) -stimulerad lipolys i inguinal fettkuddar 11 . Tidigare forskning tyder också på att långvarig aktivering av TRPV1 genom CAP aktiverar PKA 12 . Eftersom aktiveringen av PKA stimulerar lipolys 13 , 14 , som mäter både basal och PKA-beroende stimulerad lipolys i inguinal fettkuddar isolerade från NCD eller HFD (± CAP) -födda möss efter 32 veckors utfodring av respektive dieter, kommer att validera rollen som TRPV1 Aktivering i lipolys.
Denna artikel beskriver en effektiv metod för att bestämma basal och stimulerad lipolys. Även om andra metoder som utnyttjar radioaktiva isotoper av glycerol och tråkig högprestanda vätskekromatografi eller gaskromatografi / masspektrometri för mätningar 15 , 16 är tillgängliga, erbjuder denna metod en mer direkt, enkel och kostnadseffektivTeknik för att bestämma lipolys i fettvävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uppdelningen av TGL i glycerol och fettsyror katalyseras av ATGL 9 under basal lipolys och orkestreras av en uppsättning proteiner innefattande aktiveringen av adenylylcyklas / PKA-beroende vägen under stimulerad lipolys 21 , 22 , 23 . Förbättring av lipolys ökar plasmakoncentrationerna av fettsyror för transport och energianvändning 24 . Fettsyror tas upp av mitokondrier s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av AHA-priset nr 15BGIA23250030, National Institute of General Medical Sciences av NIH under pris nummer 8P20 GM103432-12 och University of Wyoming Faculty Grant i Aid to BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
