LERLIC-एमएस / एमएस में गहन विशेषता के लिए और Glutamine की मात्रा और asparagine Deamidation शॉटगन प्रोटिओमिक्स में
Summary
यहाँ हम लंबे समय से लंबाई इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LERLIC-एमएस / एमएस) विधि का एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह एक उपन्यास पद्धति है कि बन्दूक प्रोटिओमिक्स द्वारा पहली बार परिमाणन और glutamine और asparagine deamidation isoforms की लक्षण वर्णन के लिए सक्षम बनाता है।
Abstract
प्रोटीन deamidation की विशेषता भूमिका (रों) और इस प्रोटीन posttranslational संशोधन (PTM) मानव विकृति और अन्य जैव रासायनिक संदर्भों में की क्षमता को समझने के लिए आवश्यक है। आदेश प्रोटीन deamidation के लक्षण वर्णन करने के लिए, हम हाल ही में एक उपन्यास लंबी लंबाई इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LERLIC-एमएस / एमएस) विधि है जो glutamine (Gln) और asparagine (Asn) isoform अलग कर सकते हैं विकसित किया है अत्यधिक जटिल जैविक नमूनों के लिए मॉडल यौगिकों से deamidation के उत्पादों। LERLIC-एमएस / एमएस इसलिए है, जुदाई और Gln deamidation isoforms की मात्रा के लिए पहली बन्दूक प्रोटिओमिक्स रणनीति। हम यह भी एक नई बात के रूप में, प्रदर्शित, कि नमूना प्रसंस्करण यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल LERLIC-एमएस / एमएस द्वारा अपने लक्षण वर्णन की इजाजत दी स्थिर succinimide मध्यवर्ती। इस वीडियो लेख में दिखाया गया है LERLIC-एमएस / एमएस के अनुप्रयोग वर्तमान में unknow स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैंप्रोटीन deamidation की n आणविक सरणियों। साथ ही, LERLIC-एमएस / एमएस एंजाइमों की अभिक्रियाएं कि विशिष्ट जैविक पृष्ठभूमि में deamidation धरना के आगे समझ प्रदान करता है।
Introduction
Deamidation एक प्रोटीन posttranslational संशोधन (PTM) कि asparagine (Asn) और / या glutamine (Gln) अवशेषों 1 के संशोधन के माध्यम से प्रोटीन रीढ़ की हड्डी के लिए एक नकारात्मक चार्ज का परिचय है। 1 2 अनुपात: इस संशोधन Asn अवशेषों को प्रभावित करने, जबकि एक आम 3 पर समाजिक उत्पादों isoaspartic एसिड (isoAsp) और n -aspartic एसिड (एएसपी) उत्पन्न करता है। होते हुए भी, इस अनुपात मरम्मत एंजाइम एल isoaspartyl मिथाइल (PIMT) 3, 4 के हस्तक्षेप के द्वारा बदला जा सकता। इसी तरह, Gln अवशेषों की deamidation एक उम्मीद 1 पर समाजिक गामा glutamic एसिड (γ-ग्लू) और अल्फा-glutamic एसिड isoforms (α-ग्लू) उत्पन्न करता है: 7 अनुपात 3, 5, लेकिन इस अनुपात की कार्रवाई के द्वारा स्थानांतरित किया जा सकता हर जगह का एंजाइम transglutaminase 2 और अन्य transglutaminases, सहित transglutaminase 1, एक ईnzyme हाल ही में पहचान के रूप में मस्तिष्क 6 में बाह्य पुटिकाओं के साथ जुड़े।
Deamidation की उत्पत्ति पूर्व Gln अवशेषों जिसमें transglutaminases और अन्य एंजाइमों transamidation के माध्यम से अंतर / इंट्रा-आणविक तिर्यक मध्यस्थता पर विशेष रूप से आम है, या तो सहज या एंजाइमी हो सकता है (कई जीर्ण में और इसके निहितार्थ Gln transamidation पर अधिक जानकारी के लिए 3 देख सकते हैं और घातक मानव रोगों)। इसलिए, deamidation एक PTM संरचना पर एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और प्रभावित अणुओं 4, 7, 8 के समारोह है और इसके सेवा उम्र बढ़ने 9 के रूप में आणविक घड़ी सहित अपनी विभिन्न जैव रासायनिक परिणामों के प्रकाश में में गहराई से रासायनिक लक्षण वर्णन 3 की आवश्यकता है कि है ।
हालांकि Asn अवशेषों की deamidation कर दिया गया है अपेक्षाकृत नीचे-ऊपर बन्दूक प्रोटिओमिक्स द्वारा-वर्णन 1, 10, Gln अवशेषों की deamidation अभी भी इलेक्ट्रॉन आधारित कट्टरपंथी विखंडन 11 से मॉडल यौगिकों के चुनौतीपूर्ण विश्लेषण से परे एक उपयुक्त लक्षण वर्णन विधि नहीं है। हमने हाल ही में एक उपन्यास एक आयाम बन्दूक प्रोटिओमिक्स रणनीति (LERLIC-एमएस / एमएस) 3 कि एक विश्लेषण में जटिल जैविक नमूने और मॉडल यौगिकों से Gln और Asn deamidation isoforms की जुदाई में सक्षम बनाता है विकसित किया है। LERLIC-एमएस / एमएस एक लंबे समय से लंबाई (50 सेमी) आयन एक्सचेंज स्तंभ (LAX) इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (ERLIC) मोड पर काम का उपयोग कर पेप्टाइड्स tryptic पच की जुदाई पर आधारित है और मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित है (LC- एमएस / एमएस)। इस नई विश्लेषणात्मक रणनीति चिह्नित करने के लिए और अपेक्षाकृत मानव मस्तिष्क के ऊतकों में प्रत्येक deamidated अवशेषों की हद तक quantitate इस्तेमाल किया गया हैच "> 3। फिर भी, प्रोटोकॉल को यहां बताई LERLIC-एमएस / एमएस की वीडियो इमेजिंग ब्याज की जैव रासायनिक संदर्भ में प्रोटीन deamidation की विशेषताओं का अध्ययन करने के उद्देश्य से प्रदान करेगा।
नैतिकता कथन
इस प्रोटोकॉल के सभी प्रक्रियाओं सिंगापुर में नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो को-लेख में हम LERLIC-एमएस / एमएस 3 के एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, एक विधि में गहराई से लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए है और इसे सही प्रोटीन deamidation और एंजाइमी प्रक्रियाओं इस प्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, सिंगापुर (NMRC-के-IRG-0003-2016), और NTU-NHG एजिंग रिसर्च ग्रांट के राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (: इस काम के हिस्से में शिक्षा के सिंगापुर मंत्रालय (अनुदान ARC9 / 15 टीयर 2) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया अनुदान ARG / 14,017)। हमारा अनुरोध है हमें पैकिंग सामग्री है कि इस अध्ययन संभव बनाया के साथ प्रदान की के लिए डॉ एंड्रयू अल्पेर्ट और PolyLC टीम के लिए हमारी कृतज्ञता और सबसे दिली धन्यवाद व्यक्त करना चाहेंगे।
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
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