ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド
Summary
ここでは、長尺の静電反発力 – 親水性相互作用クロマトグラフィー – タンデム質量分析（LERLIC-MS / MS）方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。これは、ショットガンプロテオミクスによってグルタミンとアスパラギン脱アミド化アイソフォームを初めて定量および特徴付けのために有効に小説の方法論です。
Abstract
タンパク質脱アミド化の特性は、人間の病理および他の生化学的文脈におけるこのタンパク質の翻訳後の改変（PTM）の役割（複数可）と潜在的可能性を解読することが不可欠です。タンパク質の脱アミド化の特徴付けを行うために、我々は最近、グルタミン（Glnで）およびアスパラギン（ASN）アイソフォームを分離することができる新規な長尺静電反発力、親水性相互作用クロマトグラフィー – タンデム質量分析法（LERLIC-MS / MS）法を開発しました高度に複雑な生物学的サンプルにモデル化合物から脱アミドの製品。 LERLIC-MS / MSは、従って、Glnの脱アミド化アイソフォームの分離および定量のための最初のショットガンプロテオミクス戦略です。我々はまた、ここで概説試料処理プロトコルはLERLIC-MS / MSによって、その特徴付けを可能スクシンイミド中間体を安定化すること、ノベルティとして、実証します。この動画の記事に示されているようLERLIC-MS / MSの応用は、現在unknowを解明するのに役立つことができますタンパク質の脱アミドのN分子アレイ。また、LERLIC-MS / MSは、異なる生物学的背景に脱アミド化を包含する酵素反応のさらなる理解を提供します。
Introduction
脱アミド化は、タンパク質の翻訳後修飾アスパラギン（ASN）および/またはグルタミン（Glnの）残基1の変形を介してタンパク質主鎖に負電荷を導入する（PTM）です。 2：1の比率のAsn残基に影響を与える一方、この変形は、一般的な3で異性体生成物イソアスパラギン酸（isoAsp）およびN -アスパラギン酸（ASP）を生成します。それにもかかわらず、この比率は、修復酵素のL-イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼ（PIMT）3、4の介入によって改変することができます。同様のGln残基の脱アミド化が期待1に異性体-γ-グルタミン酸（γ-Gluで）およびα-グルタミン酸アイソフォーム（α-Gluの）を生成する：7比3、 図5に示すように、この比は、の作用によってシフトさせることができますユビキタス酵素トランスグルタミナーゼ2及び他のトランスグルタミナーゼを含むトランスグルタミナーゼ1、E脳6の細胞外小胞に関連付けられているようnzyme最近同定されました。
脱アミド化の起点が自発的または酵素的のいずれかであることができ、前者は、トランスグルタミナーゼたのGln残基で特に一般的であり、他の酵素は、アミド交換を介して、内/分子間架橋を媒介する（いくつかの慢性中のGlnアミド交換とその影響について詳細については3を参照致命的なヒト疾患）。したがって、脱アミド化は影響を受け分子4、7、8の構造および機能に重大な波及を有し、9老化の分子時計としてのサービスなど、多様な生化学的結果に照らして、深い化学的特性3を必要とPTMであります。
アスパラギン残基の脱アミド化はされているが比較的ボトムアップショットガンプロテオミクスによって十分に特徴付け1、10、のGln残基の脱アミド化は、依然として電子系ラジカルフラグメンテーション11によってモデル化合物の困難な分析を越えて適切な特徴付け方法を持ちません。我々は最近、1回の分析で複雑な生物学的サンプルとモデル化合物からのGlnおよびAsn脱アミド化アイソフォームの分離を可能にする新規な一次元ショットガンプロテオミクス戦略（LERLIC-MS / MS）3を開発しました。 LERLIC-MS / MSは、長尺（50センチメートル）静電反発 – 親水性相互作用クロマトグラフィー（ERLIC）モードで作業イオン交換カラム（LAX）を用いてトリプシン消化ペプチドの分離に基づいており、タンデム質量分析に連結されています（LC- MS / MS）。この新しい分析戦略を特徴づけると、比較的人間の脳組織内の各脱アミド残基の度合いを定量するために使用されてきましたF "> 3。それにもかかわらず、ここで説明したプロトコルは、関心の生化学的文脈においてタンパク質脱アミド化の特殊性を研究することを目的としたLERLIC-MS / MSのビデオ画像を提供します。
倫理STATEMENT
このプロトコルのすべての手順は、シンガポールのナンヤン工科大学の施設内倫理委員会によって承認されていると制度のガイドラインに基づいて行われてきました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオ記事では、LERLIC-MS / MS 3、深い特徴付けを実行し、正確タンパク質脱アミド化の程度およびこのタンパク質の修飾に関与する酵素プロセスを決定するための方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。 LERLIC-MS / MSは、静電反発-親水性相互作用クロマトグラフィー（ERLIC）27の原理の下で長尺（50センチメートル）LAXの使用に基づいて?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シンガポール国立医学研究評議会（NMRC-OF-IRG-0003から2016）、およびNTU-NHGエイジング研究助成（：この作品は、一部には教育のシンガポール省（/ 15 ARC9を付与ティア2）からの助成金によってサポートされていましたグラントARG / 14017）。私たちは感謝の意を表したいと親切に博士アンドリュー・アルパートとポリICチームに最も誠実な感謝は、この研究を可能にした梱包資材を提供してくれました。
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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