LERLIC-MS / MS for inngående karakterisering og kvantifisering av glutamin og asparagin Deamidering i hagle Proteomics
Summary
Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden. Dette er en roman metode som gjør det mulig for første gang kvantifisering og karakterisering av glutamin og asparagin deamideringsseter isoformer av hagle proteomikk.
Abstract
Karakterisering av protein deamidering er viktig å dechiffrere rollen (e) og potensialene til dette proteinet posttranslasjonell modifikasjon (PTM) i humane patologi, og andre biokjemiske sammenhenger. For å utføre karakterisering av protein deamidering, har vi nylig utviklet en ny lang lengde elektrostatiske avstøtning-hydrofil interaksjonskromatografi-tandem massespektrometri (LERLIC-MS / MS) -metoden som kan skille glutamin (Gin) og asparagin (Asn) isoform produkter av deamidering fra modellforbindelser for å svært komplekse biologiske prøver. LERLIC-MS / MS er derfor den første hagle proteomforskning strategi for separasjon og kvantifisering av GLN deamideringsseter isoformer. Vi viser også, som en nyhet, at prøvebehandlingsprotokollen beskrevet her stabiliserer succinimidet mellomliggende tillater dens karakterisering av LERLIC-MS / MS. Bruk av LERLIC-MS / MS som vist i denne videoen artikkelen kan bidra til å belyse tiden unknown molekylære sammensetninger av protein deamidering. I tillegg gir LERLIC-MS / MS ytterligere forståelse av de enzymatiske reaksjoner som omfatter deamidering i forskjellige biologiske bakgrunn.
Introduction
Deamidering er et protein posttranslasjonell modifikasjon (PTM) som innfører en negativ ladning til selve proteinryggraden gjennom modifikasjon av asparagin (Asn) og / eller glutamin (Gin) residier 1. Denne modifikasjon mens påvirker Asn-restene genererer isomere produkter isoaspartic syre (isoAsp) og n-asparaginsyre (Asp) ved et felles forholdet 3: 1 2. Ikke desto mindre kan dette forhold endres ved intervensjon av reparasjon enzymet L-isoaspartyl metyltransferase (PIMT) 3, 4. På lignende måte, deamidering av Gln-rester genererer isomere gamma-glutaminsyre (γ-Glu) og alfa-glutaminsyre-isoformer (α-Glu) til en forventet 1: 7-forhold 3, 5, men dette forhold kan forskyves ved virkningen av den allestedsnærværende enzymet transglutaminase 2 og andre transglutaminases, inkludert transglutaminase en, en enzyme nylig identifisert som assosiert med ekstracellulære vesikler i hjernen 6.
Opprinnelsen av deamidering kan enten være spontan eller enzymatisk, den førstnevnte er spesielt vanlig på Gln-rester i hvilke transglutaminases og andre enzymer som medierer den inter / intra-molekylære tverrbinding via transamidering (se 3 for nærmere informasjon om Gln transamidering og dens konsekvenser i flere kroniske og dødelige sykdommer hos mennesker). Derfor er deamideringen en PTM som har en avgjørende ettervirkning på strukturen og funksjonen til berørte molekyler 4, 7, 8 og krever en grundig kjemisk karakterisering 3 i lys av dens forskjellige biokjemiske konsekvenser med sin tjeneste som molekylære klokke av aldring 9 .
Selv om deamidering av Asn-restene har vært forholdsvis godt karakterisert ved nedenfra og opp hagle proteomforskning 1, 10, deamidering av Gln-rester fremdeles ikke har en passende karakteristikk metode utover utfordrende analyse av modellforbindelser ved elektron-radikal fragmentering 11. Vi har nylig utviklet en ny ett-dimensjon hagle proteomforskning strategi (LERLIC-MS / MS) 3 som muliggjør separasjon av Gin og Asn deamideringsseter isoformer fra komplekse biologiske prøver og modell-forbindelser i en enkelt analyse. LERLIC-MS / MS er basert på separasjon av tryptiske peptider nedbrytes ved hjelp av en lang lengde (50 cm) ionebytterkolonne (SFO) arbeider på modus elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) og koplet til tandem massespektrometri (LC MS / MS). Denne nye analyse strategi har blitt brukt for å karakterisere og forholdsvis kvantifisere utstrekningen av hver isoaspartatholdig rest i menneskelige hjernen vevf "> 3. Ikke desto mindre vil protokollen beskrevet her gi videobilder av LERLIC-MS / MS forsøkte å studere de særegenheter protein deamidering i den biokjemiske forbindelse av interesse.
ETIKK ERKLÆRING
Alle prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Institutional Review Board av Nanyang Technological University i Singapore, og er utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne video-artikkelen presenterer vi en trinn-for-trinn-protokollen for LERLIC-MS / MS 3, en fremgangsmåte utføre grundig karakterisering og for nøyaktig å bestemme graden av protein deamidering og de enzymatiske prosesser som er involvert i denne proteinmodifisering. LERLIC-MS / MS er basert på bruken av en lang lengde (50 cm) LAX henhold til prinsippet om elektrostatiske avstøtning-hydrofile interaksjoner kromatografi (ERLIC) 27. Bruken av en lang lengde kolonne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016), og NTU-NHG Aging stipend ( Grant ARG / 14017). Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet og mest oppriktige takk til Dr. Andrew Alpert og PolyLC team for vennlig gitt oss med den originale emballasjen gjort mulig denne studien.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
