LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике
Summary
Здесь мы приводим протокол шага за шагом в длинномерной электростатическом отталкивание-гидрофильно-хроматографии тандемной масс-спектрометрии метода (LERLIC-МС / МС). Это роман методология, которая позволяет в первый раз и количественного определения характеристик глутамина и аспарагина деамидирования изоформ с помощью дробовика протеомики.
Abstract
Характеристика белок дезамидирования важно расшифровать роль (ы) и потенциальные возможности этого белка посттрансляционной модификации (PTM) в патологии человека и других биохимических контекстах. Для того чтобы выполнить характеристику белка дезамидировании, недавно мы разработали новый длинномерных электростатическое отталкивание-гидрофильное взаимодействия хромато-тандемной масс-спектрометрии (LERLIC-МС / МС) метод, который может отделить глутамина (Gln) и аспарагин (Asn) изоформы продукты дезамидирования от модельных соединений до чрезвычайно сложных биологических образцов. LERLIC-МС / МС, таким образом, первая стратегия дробовика протеомики для разделения и количественного определения Gln деамидирования изоформ. Мы также продемонстрировать, как новизна, что протокол обработки образцов описанный здесь стабилизирует сукцинимид промежуточное позволяет его характеристику с помощью LERLIC-MS / MS. Применение LERLIC-MS / MS, как показано в этом видео статьи может помочь пролить свет в настоящее время неизвестногоп молекулярных массивы белка дезамидирования. Кроме того, LERLIC-МС / МС обеспечивает дальнейшее понимание ферментативных реакций, которые включают дезамидирование в различных биологических фонах.
Introduction
Дезамидирование представляет собой модификацию белков посттрансляционная (ПТМ) , который вводит отрицательный заряд белка позвоночника за счет модификации аспарагина (Asn) и / или глутамин (GLN) остатков 1. Эта модификация в то время как остатки Asn влияющие генерирует изомерные продукты isoaspartic кислоты (isoAsp) и п -aspartic кислоты (Asp) в общем соотношении 3: 1 2. Тем не менее, это отношение может быть изменено путем вмешательства фермента ремонта L-isoaspartyl метилтрансферазы (PIMT) 3, 4. Точно так же, деамидирование Gln остатков генерирует изомерные гамма-глутаминовой кислоты (γ-Glu) и изоформы альфа-глутаминовой кислоты (α-Glu) в ожидаемом соотношении 1: 3, 5 7, но это соотношение может быть смещена под действием вездесущий фермент трансглютаминаза 2 и другие трансглутаминазы, в том числе трансглутаминаза 1, электронныеnzyme недавно идентифицирован как связанный с внеклеточной везикул в мозге 6.
Происхождение дезамидировании может быть либо спонтанным или ферментативным, бывшее особенно распространен на Gln остатках , в которых трансглутаминаза и другие ферменты опосредуют меж / внутрисистемное молекулярное сшивание с помощью переамидирования (см 3 для более подробной информации о Gln переамидировании и его последствия в некоторых хронических и смертельные заболевания человека). Таким образом, деамидирование является ПТМ , что имеет решающее резонанс на структуру и функции пораженных молекул 4, 7, 8 и требует углубленного химических характеристик 3 в свете его различных биохимических последствий , включая его службы в качестве молекулярных часов старения 9 ,
Несмотря на то, деамидирование Asn остатков было относительно хорошо характеризуются снизу вверх дробовика протеомики 1, 10, деамидирование Gln остатков до сих пор не имеет подходящий метод характеризации за пределы сложного анализа модельных соединений с помощью электронно-радикальной фрагментации на основе 11. Недавно мы разработали новый один размер дробовика протеомики стратегию (LERLIC-МС / МС) 3 , что делает возможным разделение Gln и Asn деамидирования изоформ из сложных биологических образцов и модельных соединений в одном анализе. LERLIC-МС / МС основан на разделении триптических пептидов переваривали с использованием длинномерных (50 см) ионообменная колонка (LAX) работает в режиме электростатического отталкивания-гидрофильное взаимодействие хроматографии (ERLIC), и в сочетании с тандемной масс-спектрометрии (АЯ МС / МС). Эта новая аналитическая стратегия была использована для характеристики и относительно количественной оценки степени каждого дезамидированного остатка в тканях мозга человекае "> 3. Тем не менее, протокол описанный здесь будет предоставлять видео съемки LERLIC-MS / MS , направленную на изучение особенностей белков дезамидирования в биохимическом контексте интересов.
ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ
Все процедуры этого протокола были одобрены этическими комитетами в Наньянском технологическом университете в Сингапуре и были выполнены в соответствии с институциональными рекомендациями.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом видео-статье мы приводим протокол шага за шагом LERLIC-MS / MS 3, способ для выполнения углубленной характеристики и точно определить степень белка дезамидирования и ферментативных процессы , участвующих в этой модификации белка. LERLIC-МС / МС основан на использовании длинн?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами Министерства образования Сингапура (2-го уровня: Грант ARC9 / 15), Национальный Совет по медицинским исследованиям Сингапура (NMRC-OF-IRG-0003-2016) и NTU-NHG Aging Research Grant ( Грант ARG / 14017). Мы хотели бы выразить нашу признательность и искреннюю благодарность доктору Эндрю Альперт и команды PolyLC за любезно предоставил нам упаковочные материалы, которые сделали возможным это исследование.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
