Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem
Summary
Les neurones auditifs du tronc cérébral des oiseaux et des mammifères sont spécialisés pour l'encodage neuronal rapide, un processus fondamental pour les fonctions auditives normales. Ces neurones proviennent de précurseurs distincts du cerveau postérieur embryonnaire. Nous présentons des techniques utilisant l'électroporation pour exprimer des gènes dans le cerveau postérieur d'embryons de poulet pour étudier la fonction des gènes pendant le développement auditif.
Abstract
L'électroporation est une méthode qui introduit des gènes d'intérêt dans des organismes biologiquement importants comme l'embryon de poulet. Il est établi depuis longtemps que l'embryon de poulet est un modèle de recherche efficace pour l'étude des fonctions biologiques de base du développement du système auditif. Plus récemment, l'embryon de poulet est devenu particulièrement utile dans l'étude de l'expression des gènes, de la régulation et de la fonction associée à l'ouïe. L' électroporation in ovo peut être utilisée pour cibler les régions auditives du tronçon vertébral responsables de fonctions auditives hautement spécialisées. Ces régions comprennent le noyau de poulet magnocellularis (NM) et le noyau laminaris (NL). Les neurones NM et NL proviennent de précurseurs distincts des rhombomères 5 et 6 (R5 / R6). Ici, nous présentons dans l'ovo l' électroporation de gènes codés par un plasmide pour étudier les propriétés liées aux gènes dans ces régions. Nous montrons une méthode de contrôle spatial et temporel de l'expression des gènes qui favorise soit le gain, soit la perte de phénotypes fonctionnelsEs. En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés à R5 / R6, nous montrons une transfection de plasmide dans NM et NL. La régulation temporelle de l'expression des gènes peut être réalisée en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s'agit d'une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d'intérêt en présence de doxycycline (Dox). La technique d'électroporation in ovo – avec des analyses fonctionnelles biochimiques, pharmacologiques ou in vivo – offre une approche innovante pour étudier le développement des neurones auditifs et les phénomènes pathophysiologiques associés.
Introduction
Le codage neural rapide du son est essentiel pour les fonctions auditives normales. Ceux-ci comprennent les capacités de localisation du son 1 , la discographie dans la discrimination de bruit 2 et la compréhension d'autres signaux de communication pertinents au comportement 3 . Les neurones analogues situés dans le tronc cérébral auditif des oiseaux et des mammifères sont hautement spécialisés pour un codage neural rapide 4 . Ceux-ci incluent le noyau de poulet magnocellularis (NM), le noyau laminaris (NL) et leurs analogues de mammifères, le noyau cochléaire antéroventral (AVCN) et l'olive supérieure médiale (MSO), respectivement 5 . Cependant, les mécanismes de développement régulant le codage rapide des neurones sont mal compris dans le tronc cérébral auditif. Par conséquent, il est avantageux d'étudier des gènes spécifiques qui sont responsables de l'encodage neural rapide afin de mieux comprendre leur expression, leur régulation et leur fonction au seinDéveloppement de l'école.
L'embryon de poulet en développement est un outil de recherche efficace et bien établi pour étudier les questions biologiques fondamentales du développement du système auditif 6 , 7 . Des avancées moléculaires récentes ont abordé ces questions biologiques dans l'embryon de poulet en développement en exprimant ou en abaissant les gènes d'intérêt afin d'analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . L'étude du rôle réglementaire des gènes spécifiques est un progrès important dans la compréhension des pathologies associées aux déficits auditifs. Ici, nous présentons dans l' électroporation ovo de gènes codés par plasmide dans le tronc cérébral auditif de poulet où un codage neural rapide du son se produit 10 . En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés aux rhombomères 5 et 6 11 , 12 (R5 /R6), nous montrons un contrôle spatial de la transfection du plasmide dans NM et NL. En outre, nous montrons une régulation temporelle de l'expression en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s'agit d'une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d'intérêt en présence de doxycycline (Dox) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ovo, l' électroporation est une méthode d'expression ou de suppression des gènes d'intérêt afin d'analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . Dans l'embryon de poulet, il s'agit d'une méthode innovante pour exprimer des gènes encapsulés en plasmides dans différentes régions du tronçonnage auditif 8 . Pour assurer une expression optimale, plusieurs étapes critiques sont requi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria et Mme Ximena Optiz-Araya pour une assistance initiale avec la mise en place du protocole et pour la fourniture de plasmides. Ce travail a été soutenu par la subvention NIY / NIDCD DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
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