JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Published: May 18, 2017
doi:
10.3791/55655
, , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

בשיטה זו, אנו מציגים תהליכים ביוכימיים לבידוד מהיר ויעיל של חלבונים בינוניים (IF) חלבונים מרקמות עכבר מרובות. IFs מבודד ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים שינויים שלאחר translational ידי ספקטרומטריית מסה בדיקות ביוכימיים אחרים.

Abstract

סיבים בינוניים (IFs), יחד עם חוטים actin ו microtubules, טופס cytoskeleton – מרכיב מבניים קריטיים של כל תא. תפקוד תקין IFs מספקים תאים עם עמידות מכנית ומתח, בעוד cytoskeleton IF מתפקדת פשרות בריאות הסלולר כבר קשור עם מחלות אנושיות רבות. שינויים לאחר טרנספורמציה (PTM) מסדירים בצורה ביקורתית את הדינאמיקה של IF בתגובה לשינויים פיזיולוגיים ובתנאי לחץ. לכן, היכולת לפקח על השינויים בחתימת ה- PTM של IFs יכולה לתרום להבנה תפקודית טובה יותר, ובסופו של דבר מיזוג, של מערכת ה- IF כמגיב מתח במהלך פגיעה סלולרית. עם זאת, מספר גדול של חלבונים IF, אשר מקודדים על ידי יותר מ -70 גנים בודדים לידי ביטוי באופן תלוי רקמות, הוא אתגר גדול במיון את החשיבות היחסית של PTM שונים. לשם כך, שיטות המאפשרים ניטור של PTMs על חלבונים IFעל רמה אורגניזם רחב, ולא עבור בני משפחה מבודדים של המשפחה, יכול להאיץ את התקדמות המחקר בתחום זה. כאן, אנו מציגים שיטות ביוכימיות לבידוד של החלק הכולל, דטרגנט מסיסים, וחלק עמידים דטרגנט של חלבונים IF מ 9 רקמות עכבר שונות (המוח, הלב, הריאות, הכבד, המעי הדק, המעי הגס, הלבלב, הכליות, ו טְחוֹל). אנחנו עוד להדגים פרוטוקול אופטימיזציה לבידוד מהיר של חלבונים IF באמצעות מטריקס lysing ו homogenization אוטומטי של רקמות עכבר שונות. פרוטוקול אוטומטי שימושי עבור אפיון פרופילים IFS בניסויים עם נפח מדגם גבוה (כגון מודלים המחלה מעורבים בעלי חיים מרובים קבוצות ניסיוניות). הדגימות שנוצרו יכול להיות מנוצל עבור ניתוחים במורד שונים, כולל ספקטרומטריית מסה מבוססי ספקטרומטריית מסה. באמצעות שיטות אלה, אנו מספקים נתונים חדשים כדי להראות כי אם חלבונים ברקמות עכבר שונות (המוח והכבד) עוברים שינויים מקבילים לגבי expres שלהםSion רמות ו PTMs במהלך ההזדקנות.

Introduction

IFs הם משפחה של חלבונים שבני אדם מקודדים על ידי 73 גנים ומסווגים לשישה סוגים עיקריים: סוגים I-IV הם cytoplasmic ( כגון אפיתל וקראטינים של שיער (K), דגימת מיוציטים, נוירופילמנטים, חלבון חומצי פיבריללי גלילי (GFAP) ואחרים); סוג V הם lamins גרעיני; וסוג VI הם IFs בעדשת העין 1 . מבחינת האבולוציה המולקולרית שלהם, אם לחלבונים יש שלושה תחומים נפוצים: תחום משוכלל של מוט "סליל", ותחום "ראש" ו"זנב "גלובלי. אם tetramers חלבון להרכיב טופס מבשרי קצר, אשר משולבים בסופו של דבר לתוך חוטים בוגרים כי מבנה מבנים cytoskeletal דינמי מבנים נוקלאוסקלטליים המעורבים בהגנה מכנית 2 , מתח חישה 3 , 4 , תקנה של שעתוק 5 וצמיחה, פונקציות חיוניות אחרות קריטי"> 1 , 6 , 7 .

החשיבות הפונקציונלית של מערכת ה- IF מודגשת על ידי קיומו של מחלות אנושיות רבות הנגרמות על ידי מוטציות של גנים IF, כולל נוירופתיות, מיופתים, הפרעות בשבריריות העור, הפרעות בתפקוד מטבולי ותסמונות מוקדמות של הזדקנות מוקדמת. כמה מוטציות גן IF לא לגרום, אבל predispose נשאים שלהם התקדמות המחלה, כגון קרטין אפיתל פשוט מחלת כבד 9 . זה האחרון בשל הפונקציות הקריטיות להגנה על הלחץ של IFs באפיתליה. IFs באופן כללי הם בין חלבונים הסלולר שופע ביותר בתנאים הבסיסיים, אבל הם עוד יותר המושרה חזק במהלך סוגים שונים של מתח 10 . לדוגמה, מחקרים שנערכו לאחרונה מעריכים את השינויים ב- protea-wide ב- nematode C. elegans שהראו כי מספר רב של IFS הם בעלי רמה גבוהה ונוטים לצבורOn במהלך ההזדקנות האורגניזמים 11 , 12 . מאחר ותחזוקת מבנה IF תקין היא חיונית להתנגדות סלולרית לצורות שונות של לחץ 10 , אם הצבירה עשויה גם היא לתרום לירידה תפקודית במהלך ההזדקנות. עם זאת, מחקרים ברמת האורגניזמים בודקים מספר רב של יונקים חלבונים IF על פני רקמות שונות בלחץ הם חסרים.

IFs הם מבנים דינמיים מאוד להסתגל כדי לענות על דרישות הסלולר. Keratins, למשל, עוברים רכיבה עצמאית ביוסינתזה בין בריכת חלבון מסיס (לא פילמנטית) ו מסיס (נימי) חלבון 13 . בתנאים פיזיולוגיים רגילים כ -5% ניתן להפיק את מאגר K8 / K18 הכולל במאגר ללא חומרי ניקוי, בהשוואה לכ -20% שניתן להסיסם בחומר הניקוי הלא יוניד Nonidet P-40, אשר ניתן להשוותו ביוכימית ל- Triton- X100 14 , </sלמעלה> 15 . במהלך מיטוזה יש עלייה ניכרת את מסיסות של סוג פשוט אפיתל K8 ו K18 14 , אשר ניכרת פחות אפידרמיס keratins אבל נראה יותר ב vimentin ו III סוג אחר IF חלבונים 15 , 16 . תכונות מסיסות של חלבונים IF הם מוסדרים בחוזקה על ידי זרחון, שינוי שלאחר טרנסלוציאציה המפתח (PTM) עבור סידור נימה מסיסות 17 , 18 , 19 , 20 . רוב ה- IFs עוברים תקנה נרחבת על ידי מספר PTMs באתרים משומרים, וכתוצאה מכך שינויים פונקציונליים 17 .

מטרת שיטה זו היא להציג חוקרים חדשים בתחום IF למיצוי ביוכימי ושיטות אנליטיות לחקר חלבונים אם על פני רקמות עכבר מרובות. ספֵּצִיפִי, אנו מתמקדים בבידוד של חלבונים IF באמצעות שיטת מיצוי מלח גבוהה והערכת שינויים ב- PTM באמצעות ספקטרומטריית מסה ועל-ידי נוגדנים המכוונים ל- PTM. שיטות אלה מבוססות על הליכים שפורסמו בעבר, אך כוללים שינויים לחילוץ סוגים שונים של חלבונים IF כדי לחשוף מנגנון נפוץ לרגולציה בכל רחבי המשפחה. לדוגמה, acetylation K8 ב שאריות ליזין מסוים מסדיר ארגון נימה, בעוד hyperacetylation מקדם K8 מסיסות ויצירת המצרפי 22 . מחקרים גלובליים חדשים proteomic Profiledic יש גם גילה כי רוב הרקמה ספציפית IF חלבונים גם מטרות acetylation וכי רוב אתרי acetylation IF מוגבלים לתחום מוט משומר מאוד. זה מדגיש את הצורך בשיטות המתאימות פרופיל גלובלית של מערכת IF. כמו כן, אנו מציגים שיטה מהירה של בידוד חלבונים IF מ רקמות מרובות באמצעות homogenization אוטומטי Optiמטריצה ​​lysing. ההכנות כתוצאה מתאימים לניתוח PTM במורד הזרם באמצעות ספקטרומטריית מסה ושיטות אחרות.

Protocol

הפרוטוקול מאושר ומבוצע על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה. 1. הכנות הכן חיץ טריטון- X (1% Triton X-100, 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), להעלות את נפח פוספט שנאגרו מל?…

Representative Results

שיטה חדשה מהירה עבור מיצוי מבוסס מלח גבוהה של חלבונים IF מ רקמות העכבר מרובים באמצעות מטריקס lysing. השיטה המסורתית 25 , 26 של בידוד חלק ?…

Discussion

שיטות המאפשרות אפיון ביוכימי של חלבונים IF יכול להיות שימושי כדי להבין תופעות פתופיזיולוגיות רבות במערכות יונקים, שכן אם חלבונים הם גם סמנים מאפננים של מתח הסלולר והרקמה 29 . העיקרון שמאחורי השיטה הנוכחית מבוסס על ההליכים הראשונים שפותחו בשנות השבעים והש…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מעניקה NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], ו P30 DK034987 [ל UNC- קפלה היל]. המחברים מודים Deekshita Ramanarayanan לעזרה עם qPCR וניסוי כתם המערבי.

Materials

Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads – Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in ‘simple’ epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. . The laboratory mouse. , (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. . Manual of cardiovascular proteomics. , (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Tags

Keywords: Intermediate Filament ProteinsPost-translational ModificationsTriton X-100 BufferHigh Salt BufferPBS EDTA BufferSDS Sample BufferCentrifugationHomogenization
check_url/fr/55655?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image