Vi udviklet en ny teknik i elektronmikroskopi, "flash-og-freeze", som muliggør visualisering af membran dynamik med ms tidsopløsning. Denne teknik kombinerer optogenetic stimulering af neuroner med højtryks-frysning. Her viser vi de procedurer og beskrive de protokoller, i detaljer.
Celler konstant ændre deres membran arkitektur og protein fordeling, men det er yderst vanskeligt at visualisere disse begivenheder på en tidsmæssig og rumlig opløsning af størrelsesordenen ms og nm. Vi har udviklet en tidsopløst elektronmikroskopi teknik, "flash-og-freeze", der inducerer cellulære begivenheder med optogenetics og visualiserer de resulterende membran dynamik ved at fryse cellerne ved definerede tidspunkter efter stimulering. For at demonstrere denne teknik udtrykte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kationkanal, i mus hippocampale neuroner. En lysglimt stimulerer neuronal aktivitet og inducerer neurotransmitter-frigivelse fra synaptiske terminaler ved fusion af synaptiske vesikler. Den optogenetic stimulation af neuroner er koblet med højtryks-frysning at følge morfologiske ændringer under synaptisk transmission. Ved hjælp af en kommerciel instrument, vi erobrede fusion af synaptiske vesikler og genopretning af Synaptic vesikelmembranen. At visualisere hændelsesforløbet, blev store datasæt genereres og analyseret blindt, idet morfologiske ændringer blev fulgt i forskellige celler over tid. Alligevel flash-og-freeze tillader visualisering af membran dynamik i elektronmikrografer med ms tidsopløsning.
Visualisere membran og protein dynamik i en celle er et vigtigt skridt i retning af at forstå cellebiologi af bestemte processer. Dynamisk menneskehandel hændelser kan registreres ved hjælp af lys eller fluorescens mikroskopi. Men den subcellulære sammenhæng i vid udstrækning mangler i sådanne billeder, fordi subcellulære strukturer kan ikke helt "malet" af farvestoffer eller fluorescerende prober og løses rumligt og spektralt 1, 2. På den anden side, mens elektronmikroskopi kan afgrænse subcellulære arkitektur i udsøgte detaljer, kan det ikke fange cellulære dynamik, fordi prøverne skal fastsættes forud for billeddannelse. Det er således typisk ikke tilstrækkelig til fuldstændigt at forstå cellulære dynamik anvendelse af kun en afbildningsmodalitet.
At overvinde begrænsningerne ved lys- og elektronmikroskopi, har korrelative mikroskopiteknikker blevet udviklet. Korrelativ lys- og elektronmikroskopi(CLEM) visualiserer intracellulære dynamik ved hjælp af lysmikroskopi og underliggende subcellulære strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler engageret i forskellige processer, såsom cytokinese og endocytose 3, 4, 5, 6, er levende afbildes og derefter bearbejdet til elektronmikroskopi. Selvom CLEM fanger visse aspekter af intracellulære dynamik, er der fire faktorer, der begrænser nytten af denne tilgang. Første er den tidsmæssige opløsning begrænset af hvor hurtigt cellerne kan immobiliseres, hvilket typisk tager s – min grund af den langsomme diffusion og reaktion af fikseringsmidler 7. For det andet er den subcellulære arkitektur observerede post facto 8; derfor kan de dynamiske morfologiske ændringer ikke taget med denne fremgangsmåde. Tredje, fluorescens og elektronmikrografier kan ikke præcist rettet grund væv shrinkage forårsaget af dehydrering under fremstillingen prøven til elektronmikroskopi 9, 10. For det fjerde vil begivenheder som cytokinese og endocytose ikke finde sted på samme tidspunkt i hver celle 5, 11, og dermed skal en bestemt celle, der er engageret i tilfælde identificeres fra en stor population af celler. Denne proces er ofte besværlig. Således er en ny fremgangsmåde er nødvendig for at inducere bestemte begivenheder i hver celle og til at fange de resulterende cellulære dynamik af den hurtige immobilisering af celler ved definerede tidspunkter.
For nylig har flere redskaber blevet udviklet til at inducere specifikke cellulære dynamik med lette (optogenetics). Channelrhodopsin er en lysfølsom, ikke-selektive kationkanal isoleret fra Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Når channelrhodopsin udtrykkes i neuronal membraner, en kort lysglimt inducerer en tilstrømning af natriumioner i neuroner og udløser et aktionspotentiale 14, 15. Aktionspotentialet derefter udbreder i de synaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikler fusionerer inden for millisekunder 16, 17, 18 Derfor channelrhodopsin inducerer neuronal aktivitet. At følge membran dynamik på synaptiske terminaler, skal neuroner immobiliseres på definerede tidspunkter efter stimulering med ms præcision.
At fange membran dynamik efter induktion neuronal aktivitet, vi koblet lys stimulering med højtryks-frysning 17, 18, 19. Højtryks-frysning muliggør næsten øjeblikkelig immobilisering af celler med reduceret iskrystaldannelse 20. Iskrystaller can briste membraner og forstyrre den subcellulære arkitektur 21. Ved at variere tidsintervallerne mellem stimulering og frysning, blev membranen handel inden synaptiske terminaler fanget efter induktionen af et aktionspotentiale.
Her viser vi eksperimentelle procedurer under anvendelse af en kommercialiseret højtryks-fryser, der kobler en ms tidsmæssig kontrol af lys stimulering med højtryks-frysning. I modsætning til andre instrumenter, som kræver en ekstern enhed til at styre lys stimulation og frysning, er lysstimulering fuldt integreret i dette system og kan anvendes med ms præcision 19. Denne fremgangsmåde involverer flere trin. 1) Mus hippocampale neuroner dyrkes på safir diske og inficeret med lentivirus bærer en ekspressionsvektor til channelrhodopsin 18. 2) Neuroner stimuleres og fryses ved definerede tidspunkter efter stimulering. 3) forglasset vand er erstatningd med et organisk opløsningsmiddel, mens lipider og proteiner er tværbundet ved fikseringsmidler at bevare det intracellulære arkitektur. 4) Prøverne infiltreret og indlejret i epoxyharpiks. 5) Ultratynde snit opsamles under anvendelse af en ultramikrotom. 6) Tyndslib afbildes på en transmissionselektronmikroskop. 7) Billede indsamling og analyse udføres blindt med hensyn til tidspunkter eller genotyper. Cellulære dynamik kan bestemmes ved rekonstruktion af tidsopløste billeder 17, 18. Prøve forberedelse (trin 2 – 5 ovenfor) kræver en uge, men den efterfølgende billedanalyse kræver måneder til et år.
Den "Flash-og-freeze" tilgang visualiserer membran dynamik ved at inducere en særlig cellulær hændelse med optogenetics og ved at fryse cellerne ved definerede tidspunkter efter stimulering 19. I denne demonstration benyttede vi channelrhodopsin, en lysfølsom kationkanal, stimulere neuroner og fanget fusionen og genvinding af synaptiske vesikler i de synaptiske terminaler. I de senere år har mange optogenetic værktøjer der udviklet 22, 23, som alle er kompatible med flash-og-fryse. For eksempel kan organel handel induceres under anvendelse lysinduceret heterodimerisering af cryptochrome og CIB1 24. Tilsvarende kan lipidsammensætningen af plasmamembranen ændres af lysinduceret translokation af phosphoinositid phosphataser til plasmamembranen 25. Desuden er små, lysfølsomme forbindelser som azobenzen lmange konformation afhængigt af illuminationsbølgelængder. Denne konformationelle ændring kan anvendes til aktivering ligandstyrede kanaler eller for at ændre lipidsammensætning i membranen 26, 27. Bur forbindelser kan også anvendes til at inducere cellulær aktivitet. Dog kan LED anvendes i den nuværende opsætning ikke producere nok energi til uncaging; således, yderligere optimeringer af systemet sandsynligvis nødvendigt. Ikke desto mindre er anvendelser af disse lys-aktiverbare værktøjer er fleksible-mange cellulære hændelser kan induceres ved et lysglimt. "Flash-og-freeze" kan fange de resulterende membran dynamik.
Der er to primære begrænsninger for metoden "flash-og-freeze". For det første fanger "snapshots" af en bestemt begivenhed fra forskellige celler. Med andre ord er det ikke muligt at følge membran dynamik i en celle i løbet af en tidsperiode. Således til genopbygning af enhver cellulær selvt, må man erhverve og analysere et stort antal billeder fra hver prøve og på hvert tidspunkt. Endvidere i neuroner, et endnu større antal billeder er nødvendigt, da fusionen af synaptiske vesikler kun finder sted i 20 – 30% af synapserne i muse hippocampale neuroner 18, 28. Analysen af en så stor datasæt kræver enorme mængder af tid. I fremtiden billedet indsamling og analyse skal automatiseres for at gøre tilgangen mere effektiv 29, 30.
Den anden begrænsning pålægges af naturen af højtrykssiden frysning teknik. Når celler fryse, cellulær vand omlejres til dannelse iskrystaller hvis frysehastigheden er under 100 K / s 21. Disse iskrystaller kan trænge membraner eller koncentrat opløste stoffer til at ændre lokal osmotisk tryk, hvilket resulterer i brud på membraner. At undgå iskrystaller, farerneh tryk (~ 2.000 atm) påføres enhederne. På grund af den super-kølende effekt, en frysning på 100 K / s er tilstrækkelig til at forhindre vand i at danne iskrystaller ved dette tryk 21. I teorien prøver så tykke som 500 um kan fryses uden iskrystaller, men ca. 200 um sandsynligvis den praktiske grænse, som kubiske former for is tendens til at danne i tyk væv, kompromittere morfologi. Ved behandling af prøver tykkere end 5 um, anvendelsen af en ordentlig cryo-beskyttelsesmiddel, såsom BSA, er nødvendig. Dog vil BSA ændre osmolariteten af opløsningen og kan påvirke fysiologiske respons af celler. Derfor kræves omfattende forsøg kontrolforanstaltninger for at validere anvendelse af BSA i særlige systemer. Iskrystaller kan også dannes efter højtryks-frysning hvis prøverne uheld fjernes fra den flydende nitrogen-bad. Således er det kritisk at holde prøver i flydende nitrogen ved alle tider og anvende forafkølet pincet tilmanipulere dem.
Når man planlægger eksperimenter, bør overvejes følgende tre punkter. Første, den maksimale intensitet af lys (460 nm linien) er 5,5-8,0 mW / mm2. Hvorvidt denne intensitet er tilstrækkelig til at inducere aktivitet skal verificeres med live-cell imaging på et fluorescensmikroskop før flash-og-freeze eksperimenter. For det andet skal udføres forsøg ved fysiologisk temperatur. Den fase af højtryks-fryser opvarmes til 37 ° C i forsøgene med mus hippocampusneuroner 31. Endelig skal tidspunkter omhyggeligt udvalgt til at fange membran dynamik. Indledende undersøgelser indikerede, at endocytose er fuldstændig efter 100 ms af stimulation. Således blev tre yderligere tidspunkter (15, 30, & 50 ms) også undersøgt for at følge de membran dynamik 17, 18. Disse tidspunkter var nødvendige for at visualisere membran handel begivenhedsek i synaptisk transmission. Men kravet om antallet af tidspunkter er forskellige i hver celle begivenhed. Derfor bør der udtages prøver nogle tidspunkter inden initiering store datasæt samling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra Johns Hopkins University (SW). Vi takker Johns Hopkins School of Medicine Microscope faciliteten for deres tekniske support. Vi takker Erik Jorgensen og Christian Rosenmund og medlemmer af deres laboratorier for udviklingen af teknikken. Vi takker M. Wayne Davis for udformningen af den oprindelige enhed. Vi takker Paul Wurzinger, Cveta Tomova, og Delgermaa Luvsanjav for deres tekniske bistand. Vi takker også Natalie R. Hamilton og Grant F. Kusick for deres kritisk læsning af manuskriptet.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |